Л Калачнюк, Д Мельничук, Г Калачнюк - Активність ключових ензимів орнітинового циклу у разі порушень метаболізму в клітині - страница 1

Страницы:
1 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF LVIV UNIV.

Серія біологічна. 2007. Вип. 44. С. 37-42 Biology series. 2007. Is. 44. P. 37-42

Біохімія

УДК 619:616.935:636.2:577.115.3

АКТИВНІСТЬ КЛЮЧОВИХ ЕНЗИМІВ ОРНІТИНОВОГО ЦИКЛУ У РАЗІ ПОРУШЕНЬ МЕТАБОЛІЗМУ В КЛІТИНІ

Л. Калачнюк*, Д. Мельничук**, Г. Калачнюк*

*Науково-дослідний інститут біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівської національної академії ветеринарної медицини ім.С.З. Гжицького вул. Пекарська, 50, Львів 79010, Україна e-mail: lilimarg@polynet. lviv. ua **Національний аграрний університет України вул. Героїв Оборони, 15, Київ 03041, Україна

Наведено результати експериментальних досліджень в умовах in vivo та in vitro стосовно змін у ключових ензиматичних реакціях орнітинового циклу у разі порушень метаболізму в гепатоцитах новонароджених телят. Показано ймовірне зростання активності мітохондріального ензиму - орні-тинтранскарбамоїлази (на 71,6%) та цитозольного - аргінази (на 46,31%), а також відносної інтенсивності біосинтезу сечовини (на 57,61%), які можуть спостерігатися при порушеннях структурно-функціонального стану клітин печінки за умов розвитку діареї у телят.

Ключові слова: орнітиновий цикл, орнітинтранскарбамоїлаза, аргіназа, міто-хондрії, цитозоль, мембрани, гепатоцити, телята, діарея.

Дослідження особливостей засвоєння нітрогену в клітині нерозривно пов'язане з вивченням реакцій орнітинового циклу. Наукові пошуки у цьому напрямі ускладнюються проходженням реакцій окремих ланок циклу сечовиноутворення в різних субклітинних утвореннях, які розділені між собою просторово та мембранами. Тому тільки поєднання методичних підходів, які використовуються за умов in vivo та in vitro, дозволяє вирішити ряд питань, що стосуються з'ясування особливостей змін активності ключових ензимів у мітохондріях та цитоплазмі у разі порушень структурно-функціонального стану гепатоци-тів за розвитку ентеропатології у неонатальних телят. Раніше ми вже повідомляли про змі­ни у структурі багатьох молекулярних форм ліпідів [5, 6], вмісту аполіпопротеїну В [8, 9], активності ензимів початкового та кінцевого етапів біологічного окиснення карбонових сполук у мітохондріях [2] тощо [4] у разі порушень метаболізму в гепатоцитах телят за умов розвитку аліментарної діареї. Всі вони свідчать про значні відхилення в метаболічних процесах у гепатоцитах хворих тварин. В останніх експериментах були відзначені суттєві зрушення і при дослідженні особливостей знешкодження надлишків нітрогену, які з'явля­ються в клітинах печінки внаслідок посиленого метаболізму нітрогеновмісних сполук. Ре­зультатам саме з цієї ділянки досліджень присвячене нижченаведене повідомлення.

Дослідження проводили в умовах in vivo та in vitro на п'яти здорових (контроль) і п'яти з розладом травлення (дослід) новонароджених телятах. Загальна методика експериментів була описана раніше [2, 4, 5, 7, 9]. Клітинні суспензії або моношари гепатоцитів від цих телят інкубували у KRB (буфер Кребса-Рінгера [7]), який містив 1% BSA, 5 мМ глюкози, 1,0 мМ пірувату і 5 мМ NH4Cl. Після трьох останніх годин інкубу­вання (48-51 год) клітини відділяли від середовища, у якому визначали кількість утворе­ної сечовини за допомогою колориметричного методу (Sigma Kit 535, Germany або La-

© Калачнюк Л., Мельничук Д., Калачнюк Г., 2007

chema, the Czech Republic). Активність таких ключових ензимів орнітинового циклу, як мітохондріальної орнітинтранскарбомоїлази (ОТК; КФ 2.1.3.3) і цитозольної аргінази (КФ 3.5.3.1) визначали за загальноприйнятами методами [7] і виражали у нмоль утворе­ного продукту (відповідно цитруліну і сечовини) в розрахунку на 1 мкг ДНК за 1 год. Вміст білка визначали за Лоурі та співр. [12]. Визначення вмісту ДНК здійснювали спек­трофотометрично у буфері ТЕ [10 мМ тріс-HCl, рН 8,0; 1 мМ EDTA], виходячи з розра­хунку, що 1 оптична одиниця = 50 мкг/мл при 260 нм, а також за допомогою аналізу да­них електорофорезу в агарозному гелі паралельно зі "стандартами" - зразками високоочищеної ДНК із відомими концентраціями. Так, наприклад, використовували за ДНК-стандарт ДНК тимуса теляти (5мкг/мл; Sigma-Aldrich, Germany). При цьому врахо­вували, що 106 гепатоцитів містили 6,4 мкг ДНК [1,7]. Статистичне опрацювання отрима­них цифрових даних виконували за допомогою програми Microcal Origin (Version: 5,0) з використанням критерію Стьюдента "t" [6]. Одержані результати і дані для їх інтерпретації наведено в таблиці та на рисунку.

Дані таблиці свідчать, що за умов діареї відбуваються значні структурно-функціональні зрушення як на рівні цитоплазматичної ланки орнітинового циклу (і на це вказують зміни в активності аргінази), так і на рівні його мітохондріальної частини, тоб­то - орнітинтранскарбамоїлазної реакції), а також і у відносній інтенсивності біосинтезу сечовини (уреагенезу). У цілому, всі наведені показники загального процесу сечовиноут-ворення у гепатоцитах діарейних телят підвищуються на 46-71% і вказують на значні порушення у функціонуванні мембран мітохондрій, через які зазвичай постійно підтри­мується оптимальний потік необхідних інтермедіатів для забезпечення перебігу реакцій орнітинового циклу і особливо для утворення сполук, які містять карбон та нітроген.

Тут слід зазначити, що в уреотелічних організмів [3, 8, 11] через цикл сечовиноутво-рення викидається близько 90% надлишкового нітрогену. І, як показано на рисунку, сечо­вина утворюється з амонію, СО2 і аспартату в єдиному циклі, який розпочинається у гепа-тоцитах із реакції утворення карбамоїлфосфату з використанням NH4+ і НСО3— і каталізу­ється карбомоїлфосфатсинтетазою І. До речі, карбамоїлфосфатсинтетаза ІІ залучена в піри-мідиновий синтез, і джерелом нітрогену для неї слугує глютамін. У карбамоїлфосфатно-му синтезі клітина витрачає 2 молекули АТР, з яких одна використовується для активації НСО3—, а друга - для фосфорилювання карбамату. Ця реакція є незворотною. Карбамоїл-фосфат далі реагує з орнітином, утворюючи цитрулін під дією орнітинтранскарбамоїлази

Активність ключових ензимів орнітинового циклу та відносна інтенсивність біосинтезу сечовини у гепатоцитах за умов норми і за умов діареї у телят (M±m; n=5)

Показники циклу

Групи телят

Різниці до К

 

Контрольна

(К)

Дослідна (діарея; Д)

в %

ОТК1 (КФ 2.1.3.3; нмоль утвореного цитруліну / мкг ДНК год)

0,81±0,17

1,39±0,16*

+71,60

Аргіназа (КФ 3.5.3.1; нмоль утвореної сечови­ни / мкг ДНК год)

5,16±0,31

7,55±0,25*

+46,31

Уреагенез2 (нмоль N-сечовини / мкг ДНК год [13])

0,92±0,12

1,45±0,11*

+57,61

Примітка. 1ОТК - орнітинтранскарбамоїлаза; *Р<0,05 у порівнянні з К; 2уреагенез -відносна інтенсивність сечивиноутворення за останні 3 год інкубування (48-51 год) після нанесення клітин на чашки (моношарова біомодель) [1, 7].

 (ОТК) з вивільненням фосфату із карбамоїлфосфату, який володіє високим транспортним потенціалом фосфатної групи. Нвоутворений цитрулін транспортується через мембрану із мітохондрії до цитоплазми і відразу ж тут реагує з аспартатом, синтезуючи аргінінсук-цинат. Варто зауважити, що а-аміногрупа аспартату є другим постачальником нітрогену для молекул сечовини. Цікаво, що ця реакцція каталізується аргінінсукцинатсинтетазою і може бути зворотною. Вона залежить від швидкості розщеплення пірофосфату пірофос-фатазою. Наступний ензим - аргінінсукцинатліаза, розщеплює аргінінсукцинат на аргінін (безпосередній попередник сечовини) та фумарат. В останній реакції циклу під впливом аргінази утворюються молекули сечовини й орнітину.

Молекула сечовини шляхом дифузії відразу ж видаляється із гепатоцита в кровоп-лин і далі через нирки виводиться за межі організму або ж (у дорослих жуйних тварин) ще використовується і у руміно-гепатичному циклі [11]. А молекула орнітину транспор­тується у мітохондріальний матрикс, і цим самим завершується один оберт циклу сечови-ноутворення.

Дані рисунка вказують на складне просторове внутрішньоклітинне розділення реа­кцій катаболізму амінокислот і синтезу сечовини поміж цитоплазмою і мітохондріями. Такий розподіл необхідний для того, щоб попередити можливість накопичення надлиш­ків вільного аміаку у крові та проявів токсикозів. Токсичність аміаку зумовлена тим, що він сприяє відновному амінуванню а-кетоглутарової кислоти у мітохондріях, яке каталі­зується глутаматдегідрогеназою:

NH4+ + а-кетоглутарова кислота + НАД-Н <-> глутамінова кислота + НАД+.

Через те, що рівновага цієї реакції дуже зміщена вправо, то наявність аміаку спри­яє видаленню а-кетоглутарової кислоти із циклу трикарбонових кислот і цим самим не тільки пригнічує дихання, але й викликає утворення надлишку кетонових тіл із ацетил-КоА у печінці. Тому концентрація вільного аміаку у печінці строго регулюється наведе­ним шляхом.

Необхідно зазначити, що цитрулін транспортується через внутрішню мембрану за допомогою транспортера нейтральних амінокислот, а орнітин - до дихального ланцюга для переносу Н+ або для утворення цитруліну. Фумарат переноситься до мітохондріального матриксу (для перетворення у малат) транспортерами а-кетоглутарату або циклу трикарбонових кислот [3, 11].

Важливо підкреслити, що аргіназа у значних кількостях перебуває тільки у кліти­нах печінки уреотелічних тварин і синтезується тільки в цьому органі [11].

Всебічно оцінюючи вищенаведені дані й отримані результати, можна підсумувати, що у новонароджених телят за розвитку аліментарної ентеропатології значно посилюєть­ся навантаження на ензиматичні реакції орнітинового циклу. Нітроген багатьох нітроге-новмісних сполук неефективно використовуюється у процесах біосинтезу амінокислот, білка тощо та у значних кількостях губиться організмом. При цьому витрачається і знач­на кількість енергії (більше 3 молекул АТР) для підтримання посиленого функціонування циклу Кребса-Гензелейта, адже сумарна реакція тільки одного його оберту, що зображе­ний на рисунку, виражається таким балансом:

С02 + NH4+ + аспартат + З АТР + 2Н20 -» сечовина + фумарат + 2ADP + 2Р, + AMP + РР, + 5Н4".

Слід зазначити, що 4 високоенергетичні фосфати використовуються для синтезу однієї молекули сечовини. При цьому тут кожні дві молекли АТР потребують відновлен­ня із АМР, а дві інші - із ADP.

Отже, наведено конкретні експериментальні дані та молекулярно-біологічну інтер­претацію орнітинового циклу в клітинах печінки у разі порушення метаболічних проце-

Мітохондрія

PS-

O — Р=O

O-

карбомоїл-фосфат

+3 @ j ®

L-орнітин

Орнітинтранс-парбомоїлаза

цитрулін

 

1

COO-

 

Аргіназа

Аргініносукцинат-

синтаза

 

[

 

 

H2

С = N H2

NH I

H-C-NH3 I

COO-

аргініносукцинат

N H2 С =O

NH I

(CH2)3

лін H-C-NH

I "

COO-

аспартат COO-H3 N -C-H CH2 COO-

фумарат

H COO-С

II

N H2

nh H

(CH2)3

H-C-N+ H3

COO-

COO-

I

C-H

I

COO-

-ООС H

Цикл утворення сечовини - механізм, який забезпечує перетворення NH4+ у нетоксичну молекулу - сечовину. Джерела атомів для сечовини зафарбовані (О, •).сів в організмі, що спричинюється розвитком аліментарної ентеропатології у новонаро­джених телят. Вони вказують на можливу появу значних структурно-функціональних пошкоджень у гепатоцитах хворих телят. Вірогідне підвищення активності ензимів ор-нітинтранскарбамоїлази (на 71,6%) й аргінази (на 46,31%), а також посилення відносної інтенсивності біосинтезу сечовини (на 57,61%) свідчить про значні обсяги перевитрат енергії в організмі [10], що йдуть на реалізацію внутрішньоклітинного знешкодження токсичних надлишків нітрогену, перетворення їх у нешкідливу парну сполуку - сечови­ну та наступне виведення її через кровоплин, нирки, інші ланки сечовидільної системи. Виявлені зміни та можливі порушення структури і функції мітохондріальних мембран, через які прокладають свій шлях ензиматичні перетворення орнітинового циклу дають певне пояснення виснаженому станові новонароджених телят із ознаками прогресуючої діареї.

1. Калачнюк Л. Вивчення особливостей впливу екзо- і ендогенних факторів на внутріш­ньоклітинний метаболізм у гепатоцитах жуйних тварин з допомогою моношарової біомоделі // Тези доп. установ. з'їзду укр. тов-ва клітинної біології. Львів. С. 257.

2. Калачнюк Л., Мельничук Д., Калачнюк Г. Активність мітохондріальних ензимів у разі порушень ліпідного метаболізму в гепатоцитах // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. 2005. Вип. 39. C. 40-46.

3. Калачнюк Л. Г., Мельничук Д. О., Калачнюк Г. І. Молекулярні аспекти регуляції метаболізму жирних кислот і ліпідних сполук у клітинах тканин жуйної тварини // Укр. біохім. журн. 2007. №1. С. 22-45.

4. Калачнюк Л., Мельничук Д., Калачнюк Г. Молекулярні механізми регуляції синте­зу, метаболізму й секреції ліпопротеїнів у клітинах печінки // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. 2004. Вип. 38. С. 3-20.

5. Калачнюк Л., Мельничук Д., Калачнюк Г. Молекулярно-структурні зміни у фосфо-ліпідах гепатоцитів новонароджених телят у разі діареї // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. 2004. Вип. 35. С. 71-76.

6. Калачнюк Л. Г., Мельничук Д. О., Калачнюк Г. І. Молекулярно-структурні зміни у фос-фоліпідах клітин печінки за репаративної терапії неонатальних телят з аліментарною ентеропатологією // Наук. вісн. ЛНАВМ. Львів. 2005. Т. 7. № 3(26). Ч. 1. С. 44-51.

7. Калачнюк Л., Мельничук Д., Калачнюк Г. Одержання клітинних культур із печінки жуйних тварин і вивчення дії екзогенних факторів на інтрацелюлярний метаболізм у гепатоцитах // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. 2004. Вип. 37. С. 45-59.

8. Калачнюк Л., Мельничук Д., Калачнюк Г. та ін. Обсяги ароВ та інших біополімерів у клітинах печінки за репаративної терапії неонатальних телят з аліментарною ен-теропатологією // Наук. вісн. ЛНАВМ. Львів. 2005. Т. 7. № 2. Ч.1. С. 37-44.

9. Калачнюк Л., Савка О., Мельничук Д., Калачнюк Г. Аполіпопротеїн В: особливості метаболізму в клітинах печінки телят при діареї // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол.

2004. Вип. 38. С. 57-66.

10. Калачнюк Л. Г., Мельничук Д. О., Калачнюк Г. І. та ін. Зниження функцій ключо­вих мітохондріальних ензимів у пошкоджених клітинах та їх відновлення екзоген­ними фосфоліпідними комплексами // Наук. вісн. ЛНАВМ. Львів. 2006. Т. 8. № 2 (29). Ч. 1. С. 58-64.

11. Kmet' V., Baran M., Kalachnyuk G. I. Rumen ecosystem manipulation of calves and lambs by microbial preparation / Ed. K. Bod'a. Bratislava: Veda, 1990. 112 p.

12. Lowry O. H., Rosenbroudh N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. N 1. P. 265-275.

13. Strang B. D., Bertics S. J., Grummer R. R., Armentano L. E. Effect of long-chain faty acids on triglyceride accumulation, gluconeogenesis, and ureagenesis in bovine hepato-cytes // J. Dairy Sci. 1998. Vol. 81. P. 728-739.

ACTIVITY OF THE KEY ENZYMES IN THE CYCLE OF ORNITHINE UNDER ALTERATIONS OF METABOLISM IN CELL

L. Kalachnyuk*, D. Melnychuk**, G. Kalachnyuk*

*Biotechnology Research Institute of Animal Productivity S.Z. Gzhytskyi Lviv National Academy of Veterinary Medicine 50, Pekarska St., Lviv 79010, Ukraine e-mail: lilimarg@polynet.lviv.ua **National Agrarian University 15, Heroyiv Oborony St., Kyiv 03041, Ukraine

It has been presented results of experiments in vivo and in vitro to inves­tigate changes of the key enzymatic reaction in the Cycle of ornithine under alterations of metabolism in the hepatocytes of newborn calves. It has been shown significant increase of activity of the mitochondrial enzyme, ornithine transcarbomoylase, (by 71,6%) and the cytosolic enzyme, arginase, (by 57,61%) under alterations of the structural and functional state in the hepatic cells under diarrhoea development in calves.

Key words: the Cycle of ornithine, ornithine transcarbomoylase, arginase, mito­chondria, cytosol, membranes, hepatocytes, calves, diarrhoea.

Стаття надійшла до редколегії 24.08.06 Прийнята до друку 18.12.06

Страницы:
1 


Похожие статьи

Л Калачнюк, Д Мельничук, Г Калачнюк - Активність ключових ензимів орнітинового циклу у разі порушень метаболізму в клітині

Л Калачнюк, Д Мельничук, Г Калачнюк - Активність мітохондріальних ензимів у разі порушень ліпідного метаболізму в гепатоцитах