Л Орлова - Активність металопротеїнази матриксу (ммр-2) і катепсиноподібної протеїнази d у різних видів змій - страница 1

Страницы:
1 

ISSN 0206-5657. Вісник Львівського університету. Серія біологічна. 2011. Випуск 55. С. 34-38 Visnyk of the Lviv University. Series Biology. 2011. Issue 55. P. 34-38

УДК 577.15:591.466(043.5)

АКТИВНІСТЬ МЕТАЛОПРОТЕЇНАЗИ МАТРИКСУ (ММР-2) І КАТЕПСИНОПОДІБНОЇ ПРОТЕЇНАЗИ D У РІЗНИХ ВИДІВ ЗМІЙ

Л. Орлова, С. Петров

Одеський національний університет імені 1.1. Мечникова пер. Шампанський, 2, Одеса 65058, Україна e-mail: peterodessa@gmail.com

Уперше виявлено матриксну металопротеїназу-2 і катепсиноподібну протеїна-зу D в препаратах, виготовлених зі змій. Встановлено, що досліджувані препарати характеризуються різною протеолітичною активністю цих ферментів. Металопроте-їназа-2 має вищу активність порівняно з катепсин^-подібною протеїназою і робить більший вклад у загальну протеолітичну активність препаратів. Найбільша активність металопротеїнази-2 виявлена у препаратах, одержаних із гадюки звичайної (Vipera berus) і гадюки степової (Vipera ursini).

Ключові слова: протеоліз, металопротеїназа-2, катепсиноподібна протеїназа D,

змії.

В історії світової науки збереглися численні відомості про використання змій для виготовлення ліків проти багатьох хвороб. Відомо, що Пліній-старший, вчений античної епохи, «зміїні» ліки виготовляв з отрути і частин тіла плазунів. У сучасній фармакології ліки, створені на основі зміїних отрут, знімають біль, зупиняють кровотечу, лікують нервову та кісткову системи, бронхіальну астму й епілепсію [4].

Новітні наукові винаходи пов'язані з пошуком біологічно активних сполук в організмі змії, які здатні впливати на різноманітні процеси життєдіяльності організму, мають метаболічну активність, інгібуючу та розщеплювальну дії.

Одним із основних напрямів сучасних наукових досліджень є вивчення системи протеолізу як особливої форми біологічної регуляції. Протеоліз постійно відбувається в живих організмах і в оточуючому середовищі під впливом мікроорганізмів, у результаті чого виникають різноманітні біологічно активні речовини - ферменти, гормони, пептиди, амінокислоти тощо [13].

Протеолітичні ферменти, які мають високу біологічну активність, беруть участь у функціонуванні різних органів і систем організму та в регуляції біологічних процесів. Вони не тільки здійснюють неспецифічний розпад білкових молекул, а й контролюють функції та системи організму, що реалізується в реакціях загального й обмеженого протеолізу. За сучасними уявленнями, саме ферменти протеолізу підтримують рівновагу між загибеллю та деградацією клітин і їхнім відновленням [1, 5].

Протеолітичні процеси необхідні для нормального функціонування організму. По­рушення механізмів біологічної регуляції може викликати тяжкі захворювання: артрити, розсіяний склероз, ракові пухлини та ін. Протеолітичні ферменти відіграють важливу роль у метастазуванні при проходженні злоякісних клітин крізь мембрани, їхній міграції та ін­вазії у позаклітинний матрикс. У цих процесах беруть участь 4 класи протеолітичних фер­ментів - матриксні металопротеїнази, цистеїнові та серинові протеїнази, а також аспартат-протеїназа катепсин D [14].

Лізосомальні протеїнази - катепсини, до яких належить катепсиноподібна протеїна-за D, становлять найбільш вивчену групу протеолітичних ферментів і перебувають у цен­© Орлова Л., Петров С., 2011трі уваги сучасних наукових досліджень. Новітні винаходи аспартатпротеїнази D пов' язані з вивченням її ролі у пухлинному процесі різних органів і систем організму, в поєднанні дії катепсину D з іншими засобами [6].

В останнє десятиріччя проведені наукові дослідження матриксних металопротеїназ у морфогенезі, загоєнні ран, імплантації ембріонів і вивченні їхньої ролі в злоякісному пухлинному процесі. Дослідження матриксних протеїназ і регуляція їхньої активності ма­ють важливе значення для розуміння молекулярних механізмів різноманітних біологічних процесів [21].

Слід відзначити, що вчені різних країн при вивченні матриксних металопротеїназ велику увагу приділяють дослідженню змій.

Так, з отрути змії Bothrops neuwiedi виділена фібринолітична протеїназа неувідаза, яка має високий ступінь гомології з іншими металопротеїназами з отрут змій. Неувідаза розщеплює фібрин і деякі компоненти міжклітинного матриксу [18].

З отрути змії Bothrops leucurus виділена металопротеїназа лейкурозин-а, яка розчи­няє в дослідах in vitro згустки фібрину з крові та фібриногену [12].

Металопротеїнази отрути змій берітрактиваза і ярарагін активізують ендотеліальні клітини та виявляють антиагрегаційну і прокоагулянтну дію [20].

Досліджена металопротеїназа отрути щитомордника Agkistrodon halys Palas з анти­мікробною активністю до бактерій, патогенних для людини і стійких до різних лікарських засобів [19].

З отрути змій також виділений рекомбінантний домен агролізин А, який гальмує агрегацію тромбоцитів, а також інгібує адгезію клітин остеосаркоми [15].

В інформаційних джерелах описані засоби одержання інгібіторів металопротеїназ, у тому числі з отрути змії, які можуть бути використані для лікування патологій, пов' язанних з надлишком ендогених металопротеїназ [16].

Таким чином, вивчення металопротеїназ у змій є науково актуальним, але ці винаходи стосуються, в основному, тільки зміїних отрут. У світовій літературі майже відсутні дослідження активності металопротеїназ у тканинах і органах змій.

Мета нашого дослідження полягала у вивченні активності протеолітичних фермен­тів, а саме: матриксної металопротеїнази-2 і катепсиноподібної протеїнази D у препара­тах, виготовлених із різних видів змій за оригінальною технологією [Патент РФ №2034550 «Спосіб П.М. Орлова одержування засобу для лікування гнійних ран»].

Щоб визначити активність ферментів протеолітичної системи в досліджуваних пре­паратах, зокрема, металопротеїнази-2 матриксу і катепсиноподібної протеїнази D, в екс­перимент були взяті 4 зразки препаратів, одержаних із різних видів змій:

1. Вуж звичайний (Natrix natrix)

2. Гадюка степова (Virepa ursini)

3. Жовтобрюхий полоз (Coluber jugularis)

4. Гадюка звичайна (Vipera berus)

У ході експерименту використовувалися дослідні проби препаратів, розведені дистильованою водою.

Для визначення активності металопротеїнази-2 ми застосували метод Bradshaw R. S., заснований на визначенні кількості продуктів гідролізу 10% желатину при рН 7 [10].

Активність катепсин^-подібних протеїназ ми визначали за методом Anson M. L. [11], заснованим на знаходженні кількості продуктів гідролізу 1% гемоглобіну при рН 3,5, які не осаджуються 10% розчином трихлороцтової кислоти.

У ході експерименту проводили також визначення вмісту білка в досліджуваних зразках препаратів за методом Lowry [17].

Статистичну значимість відмінностей між дослідними препаратами визначали за допомогою t-критерію Стьюдента [7].

Для вивчення протеолітичної активності препаратів, виготовлених із різних видів змій, ми визначали наявність у них металопротеїнази-2 і катепсиноподібної протеїнази D. Вибір серед родини катепсинів катепсиноподібної протеїнази D обумовлений тим, що се­ред усіх протеїназ катепсинового ряду ця протеїназа є найбільш активною.

Як видно з таблиці, досліджувані препарати характеризуються різною протеолітичною активністю.

Активність матриксної металопротеїнази-2 визначали в мкмолях гліцину/мг білка, катепсиноподібної протеїнази D - в мкмолях тирозину/мг білка.

Активність металопротеїнази-2 і катепсин^-подібної протеїнази у препаратах,

виготовлених зі змій (мкмоль гліцину/мг білка; мкмоль тирозину/мг білка; М±м; n=8)

Види змій

Активність ферментів

 

Металопротеїназа-2

Катепсин D

 

(мкмоль гліцину/мг білка)

(мкмоль тирозину/мг білка)

Вуж звичайний (Natrix natrix)

117,450±20,027

0,166±0,044

Гадюка степова (Vipera ursini)

273,357±46,744

0,287±0,066

Полоз жовтобрюхий (Coluber jugularis)

244,804±30,883

0,132±0,041

Гадюка звичайна (Vipera berus)

517,184±82,438

0,117±0,041

При порівняльному аналізі активності ферментів у препаратах, виготовлених з 4-х видів змій, ми реєстрували переважну активність протеїнази ММР-2. Найбільшою актив­ністю ММР-2 характеризуються препарати, виготовлені з гадюки звичайної (Vipera berus), а також із гадюки степової (Vipera ursini). Активність металопротеїнази була найменшою у препаратах із вужа звичайного (Natrix natrix). Активність матриксної металопротеїнази-2 можна пов'язати з наявністю отрути у зміях, з яких виготовлено препарати. Більшу актив­ність виявляють препарати, виготовлені з отруйних змій.

Катепсин^-подібна протеїназа характеризується найбільшою активністю у пре­паратах, одержаних із гадюки степової (Vipera ursini) та вужа звичайного (Natrix natrix). Меншою активністю катепсин^-подібних протеїназ характеризуються препарати, виго­товлені з жовтобрюхого полоза (Coluber jugularis) і гадюки звичайної (Vipera berus). Значні розбіжності в активності цих препаратів, очевидно, можна пояснити не тільки видом змій, а й умовами їхнього життя і харчування.

Протеїназа ММР-2 (КФ 3.4.24.24) належить до родини металопротеїназ позаклітин­ного матриксу, які мають в активному центрі іони двовалентних металів Zn і Ca. Як і катеп-синоподібна протеїназа D, металопротеїназа-2 бере участь в обмеженому протеолізі, що є характерним для протеїназ широкого спектра дії. Матриксна металопротеїназа-2 - єдиний фермент, здатний до позаклітинного розщеплення колагену. Вивчення металопротеїназ має особливе значення при злоякісному рості клітин, оскільки інвазія пухлин потребує розпаду колагену [3].

Катепсиноподібна протеїназа D (КФ 3.4.23.5) характеризується високою катептич-ною активністю і здатністю руйнувати білки міжклітинного середовища. Вважається, що цей фермент бере участь у внутріклітинному гідролізі білків м' язів. При патологічних ста­нах, у тому числі і при злоякісному рості, рівень активності катепсиноподібної протеїнази D підвищується в декілька разів [9].

ISSN 0206-5657. Вісник Львівського університету. Серія біологічна. 2011. Випуск 55

Досліджувані препарати, виготовлені зі змій, свідчать, що металопротеїназа-2 ма-триксу характеризується вищою ферментативною активністю порівняно з катепсин-D-подібною протеїназою. На основі одержаних нами експериментальних даних можна зро­бити висновок про скоординовану дію специфічних білків-ферментів металопротеїнази-2 і катепсинТЗ-подібної протеїнази у протеолітичному процесі та про їхній індивідуальний вклад у загальний протеоліз. За своєю ферментативною активністю матриксна металопро-теїназа-2 вносить більший вклад у загальну протеолітичну активність препаратів.

1. Андрійчук Т. Р., Ракша Н. Г., Цудзевич Б. О., Остапченко Л. І. Участь протеолітичних ензимів у радіаційноіндукованому апоптозі лімфоцитів тимуса щурів // Укр. біохім. журн. 2009. Т. 81. № 3. С. 102-107.

2. Веремеенко К. Н. Протеолитические ферменты и их ингибиторы в медицине // Биохимия животных и человека: Республ. межвед. сб. Вып. 5. К.: Наук. думка, 1981.

С. 28-40.

3. Веремеенко К. Н., Голобородько О. П., Кизим А. И. Протеолиз в норме и при патологии. К.: Здоров'я, 1988. 200 с.

4. Костюк Є. Є. Нескінченний пошук. К.: Знання, 1971. 108 с.

5. Локшина Л. А. Протеолитические ферменты в регуляции биологических процессов // Биоорганич. химия. 1994. Т. 206. № 2. С. 142-143.

6. Пупышев А. Б. Лизосомы человека: библиометрическая оценка актуальных направлений исследований // Бюллетень СО РАМН. 2006. № 1(199). С. 106-115.

7. Рокицкий П. Ф. Биологическая статистика. Минск: Высш. шк., 1973. 320 с.

8. Сологуб Л. І., Пашковська І. С., АнтонякГ. Л. Протеази клітин та їх функції. К.: Наук. думка, 1992. 195 с.

9. Ханикова Т. А. Катепсины В, L и D и цистатин С при гемобластозах человека и экспериментальных опухолях мышей: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Новосибирск,

2004. 30 с.

10. Чернадчук С. С., Вовчук І. Л. Активність металопротеїнази матриксу (ММР-2) у ткани­нах новоутворень ендометрія та міометрія // Вісн. Одес. ун-ту. 2005. Т. 10. № 5. С. 58-63.

11. Anson M. L., Mirsky A. E. The estimation of pepsin with hemoglobin // L. Gen. Physiol. 1932. Vol. 16. N 1. P. 59-67.

12. Beilo C. A., NermogenesA. L. N., MagalhaesA. et al. Isolation and biochemical characteriza­tion of a fibrinolytic proteinase from Bothrops leucuris (white-tailed jararaca) snake venom // Biochimie. 2006. Vol. 88. N 2. P. 189-200.

13. Cari B., Curr P. Remarkabie roles of proteolysis on and bejond the ceil surface // Opinion Cell. Biol. 2000. Vol. 12. N 5. C. 606-612.

14. JedinakA., Maliar T. Inhibitors of proteases as anticancer drugs // Neoplasma. 2005. Vol. 52. N 3. P. 185-192.

15. Jia Li-Guo, Wang Xiao-Ming, Shannon John D. et al. Inhibition of platelet aggregation by the recombinant cysteine-rich domain of the hemor rhagic shake venom metalloproteinase atrolysin A // Arch. Biochem. and Biophys. 2000. Vol. 373. N 1. P. 281-286.

16. Пат. 6057297 США, МКИ С07К 5/06. Inhibitor compounds of zinc-dependent metallo-proteinases associated with pathological conditions and therapeutic use thereof / Politi Vin-cenzo, D'Alessio Silvana, Di Stazio Glovanni, et all. №09 |040446; Заявл. 18.03.98; Опубл. 02.05.00; НКИ 514/19.

17. Lowry O.H., Rosebrough N. I., Farr A. Z., Randal R. J. Proteinneasurement with Folin phe­nol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

18. Rodriques Veridiana M., SoaresAndreimar M., Guerra-Sa Renata et al. Structural and function­al characterization of neuwiedase and nonhemorrhagic fifrin(ogen) olytie metalloprotease from Bothrops neuwiedi snake venom // Biochem. and Biophys. 2000. Vol. 381. N 2. P. 213-224.

19. Samy Ramar Perumai, Gopalaksrishnakone Panampalam, Chow Vincent T.K. et al. Viper metalloproteinase (Agkistrodon halys Pallas) with antimicrobial activity against multi-drug resistant human pathogens // J. Cell. Physiol. 2008. Vol. 216. N 1. P. 54-68.

20. Schattner Mirta, Fritzen Marcio, de Soura Ventura Janaina et al. The snake venom me-talloproteases berythractivase and jaraihagin activate endotheilai cells // Biol. Chem. 2005. Vol. 386. N 4. P. 369-374.

21. Vu Thiennu H., Werb Zena. Matrix metalloproteinases: Effectors of development and normal-physiology // Genes and Dev. 2000. Vol. 14. N 17. P. 2123-2133.

Стаття: надійшла до редакції 24.09.10

доопрацьована 16.11.10

прийнята до друку 23.11.10

MATRIX METALLOPROTEINASE (MMP-2) AND CATHEPSINE LIKE PROTEINASE D ACTIVITY OF DIFFERENT SPECIES OF SNAKES

L. Orlova, S. Petrov

Mechnikov National University of Odessa 2, Shampansky Lane, Odessa 65058, Ukraine e-mail: peterodessa@gmail.com

The presence of matrix metalloproteinase-2 and cathepsine like proteinase D was first detected in preparations made from serpent's organism. It is ascertained that the exa­mined preparations are characterized with the various proteolytic activity of those ensymes. Metalloproteinase-2 prossesses higher activity compared to cathepsine-D-like proteinase and contributes more to the general proteolytic activity of preparations. The most activity of metalloproteinase-2 is detected by pireparations, obtained from common viper (Vipera berus) and orsini's viper (Vipera ursini).

Key words: proteolysis, metalloproteinase-2, cathepsine-like proteinase D, snakes.

АКТИВНОСТЬ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ МАТРИКСА (ММР-2) И КАТЕПСИНОПОДОБНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ D У РАЗНЫХ ВИДОВ ЗМЕЙ

Л. Орлова, С. Петров

Одесский национальный университет имени И. И. Мечникова пер. Шампанский, 2, Одесса 65058, Украина e-mail: peterodessa@gmail.com

Впервые выявлено наличие матриксной металлопротеиназы-2 и катепсиноподобной протеиназы D в препаратах, изготовленных из змей. Установлено, что исследуемые препараты характеризуются различной протеолитической активностью этих ферментов. Металлопротеиназа-2 обладает более высокой активностью сравнительно с катепсин^-подобной протеиназой и вносит больший вклад в общую протеолитическую активность препаратов. Наибольшая активность металлопротеиназы-2 выявлена в препаратах, полученных из гадюки обыкновенной (Vipera berus) и гадюки степной (Vipera ursini).

Ключевые слова: протеолиз, металлопротеиназа-2, катепсиноподобная протеиназа D, змеи.

Страницы:
1 


Похожие статьи

Л Орлова - Активність металопротеїнази матриксу (ммр-2) і катепсиноподібної протеїнази d у різних видів змій