І Кушкевич - Акумуляція іонів важких металів клітинами chlorobium limicola 1mb k-8 та їхні цитоморфологічні зміни за впливу кадмій сульфату - страница 1

Страницы:
1  2 

ISSN 0206-5657. ВісникЛьвівського університету. Серія біологічна. 2011. Випускбб. С. 199-207 Visnykofthe Lviv University. Series Biology. 2011. Issue 56. P. 199-207

УДК579.811.2/3:546.81

АКУМУЛЯЦІЯ ІОНІВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ КЛІТИНАМИ CHLOROBIUM LIMICOLA 1MB K-8 ТА ЇХНІ ЦИТОМОРФОЛОГІЧНІ ЗМІНИ ЗА ВПЛИВУ КАДМІЙ СУЛЬФАТУ

І. Кушкевич, С. Гнатуш, О. Кулачковський

Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського, 4, Львів 79005, Україна e-mail: Ivan_Kushkevych@ukr.net

Встановлено, що клітини зелених сіркобактерій Chlorobium limicola 1MB K-8 здатні акумулювати Cu2+, Pb2+ і Cd2+. Акумуляція іонів важких металів залежить від їхньої концентрації в середовищі. Досліджено цитоморфологічні зміни клітин фото-трофних зелених сіркобактерій C. limicola 1MB K-8 за впливу різних концентрацій кадмій сульфату. Показано, що 1,5-2,0 мМ CdSO4 спричиняє зміни структури цито­плазматичної мембрани та її відшарування від клітинної стінки. Цитоплазма за цих умов була ущільнена, нагромаджувались електроннощільні речовини. Збільшення концентрації солі Кадмію до 2,5 мМ спричинило розпадання ланцюгоподібних угру­повань клітин C. limicola 1MB K-8.

Ключові слова: фототрофи, зелені сіркобактерії, токсичність, іони Кадмію, морфологія.

У місцях сіркодобувних кар'єрів часто виникає складна екологічна ситуація, обумовлена порушенням процесів кругообігу сірки. Екологічна проблема виникла на місці колишнього Яворівського сірчаного кар'єру у зв'язку з припиненням його роботи. Цей кар'єр після наповнення водами річок, що протікають через його територію, підземними водами, а також опадами, перетворили на озеро з метою створення природно-рекреаційної зони [3]. Виникла необхідність оцінити можливості біологічного окиснення сірководню фотосинтезувальними бактеріями, а також перспективи відновлення рівноваги сполук сірки даного району природним шляхом.

З 2000 р. кафедра мікробіології Львівського національного університету імені Івана Франка розпочала роботи з вивчення мікроорганізмів водойм родовища, які забезпечують перетворення сполук Сульфуру. Показано, що висока концентрація сульфатів і наявність органічних речовин, які надходять із водами річок, сприяють розвиткові сульфатвідновлювальних бактерій, продуктом життєдіяльності яких є сірководень. Останній є токсичною сполукою і створює серйозну екологічну небезпеку [1,2].

Завдяки діяльності зелених сіркобактерій, що використовують сірководень як донор електронів, водойми очищуються від нього [14]. Фотосинтезувальні сіркобактерії, які населяють глибинні ділянки водойм, не дають цій сполуці поширюватись у верхні шари води, що забезпечує можливість розвитку там багатьох рослинних і тваринних організмів [17].

Результати аналізу вмісту у воді іонів важких металів, зокрема Cd2+, Pb2+ та Cu2+, протягом кількох останніх років показали їхнє швидке нагромадження у придонних від­кладах, що призводить до порушень функціонування мікробіоценозів, які населяють цю водойму [6].

Відомо, що іони важких металів у концентрації 1-2 мМ негативно впливають на клітини мікроорганізмів [5]: порушують фотосинтез, цілісність мембран, процеси трансляції [13], структуру та функціонування багатьох ферментів [15, 16].

© Кушкевич І., Гнатуш С., Кулачковський О., 2011

Іони металів можуть нагромаджуватися всередині клітин. Описано внутрішньоклітин­не нагромадження іонів Аргентуму, Цинку, Кобальту, Кадмію [16, 20]. Нагромадження іонів металів усередині клітин забезпечується функціонуванням систем як активного, так і пасив­ного транспорту. Встановлено, що найбільша акумуляція відбувається в перші години взаємо­дії клітин бактерій з іонами металів [8, 9].

У літературі немає даних про акумуляцію іонів важких металів фотосинтезувальни-ми аноксигенними зеленими сіркобактеріями, а також про їх вплив на цитоморфологічні зміни C. limicola 1MB K-8.

Метою роботи було дослідити здатність клітин C. limicola 1MB K-8 акумулювати іони важких металів, а також визначити можливість цитоморфологічних змін їхніх клітин за впливу Cd2+.

Матеріали та методи досліджень

Фототрофні зелені сіркобактерії Chlorobium limicola 1MB К-8, виділені з води Яво­рівського озера, ідентифіковані на кафедрі мікробіології Львівського національного уні­верситету імені Івана Франка і задепоновані у Депозитарії Інституту мікробіології та ві­русології ім. Д. К. Заболотного НАН України [4, 11].

Бактерії вирощували за анаеробних умов при температурі +25.. .+28°С у середовищі GSB [18]. Освітленість становила 40 лк, забезпечувалася лампою розжарювання потуж­ністю 60 Вт і була цілодобовою. Значення рН середовища було нейтральним (рН~7,0) [4].

Для дослідження здатності акумулювати іони важких металів, клітини бактерій від­бирали на середині експоненційної фази росту, інкубували протягом 3 годин у середовищі GSB з різними концентраціями (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 та 2,5 мМ) CuS04, CdSO4 чи Pb(NO3)2 та відмивали 0,9% NaCl. У контрольний варіант солі металу не вносили.

Для отримання безклітинних екстрактів відмиті клітини переносили в 0,1 М калій-фосфатний буфер (рН 7,5) і руйнували на ультразвуковому гомогенізаторі УЗДН-2Т при 22 кГц протягом 5 хв при 0°С. Уламки клітин відокремлювали центрифугуванням при 12-15 тис. об/хв при 4°С упродовж 30 хв.

Концентрацію поглинутих іонів металів визначали у безклітинних екстрактах на іонометрі (рН-150М) за допомогою іонселективних електродів на Купрум марки ЭЛИС-131Cu, Кадмій марки ЭЛИС-131Сс1 та Плюмбум марки ЭЛИС-131РЬ, використовуючи ка­лібрувальні криві.

Для побудови калібрувальної кривої визначали різницю потенціалів E(mV) між іон-селективним і порівняльним електродами у розчинах CuS04, CdSO4 та Pb(NO3)2 з концен­траціями від 0,0001 до 1 моль/л, у перерахунку на концентрацію іонів металу.

Концентрацію поглинутих іонів Купруму Кадмію та Плюмбуму в клітинах розра­ховували, використовуючи пакет програм Excel, за формулами, одержаними з рівнянь ка-

Е-189,41 £-150.45

лібрувальних кривих: С = 10 ;36е   - для іонів Купруму, С = 10 - для іонів

Кадмію та С = 10 19:933 - для іонів Плюмбуму.

Знаходили основні статистичні показники за безпосередніми даними (середнє ариф­метичне - М; стандартна похибка середнього арифметичного - m). Для оцінки достовір­ності різниці між статистичними характеристиками двох альтернативних сукупностей даних обчислювали коефіцієнт Стьюдента [7]. Достовірною вважалася різниця при показ­нику достовірності Р>0,95.

Статистичне опрацювання результатів проводили, використовуючи програми Ехсеї та Origin.

З метою дослідження цитоморфологічних характеристик фотосинтезувальних сір­кобактерій за впливу CdSO4, C. limicola 1MB К-8 вирощували у середовищі за різних кон­центрацій (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мМ) солі. У контрольному варіанті солі металу додатково не вносили.

Для електронно-мікроскопічних досліджень клітини відмивали 0,9% NaCl та оса­джували центрифугуванням при 10 000 об/хв 15 хв. Інтактні клітини фіксували в 1,5% вод­ному розчині KMnO4 упродовж 20 хв при кімнатній (+20°С) температурі. Постфіксацію про­водили з використанням 1% OsO4 у какодилатному буфері 90 хв при 0°С. Фіксовані клітини промивали, обезводнювали в розчинах зі зростаючими концентраціями етанолу й окису пропілену. Зразки переносили в епоксидну смолу Ероп 812. Ультратонкі зрізи отримували на ультрамікротомі УМТП-6 і контрастували цитратом свинцю за Рейнольдсом [19].

Перегляд і фотографування зразків проводили на електронних трансмісійних мікро­скопах УЕМВ-100 Б і ПЕМ-100 при прискорюючій напрузі 75 кВ. Кінцеве збільшення на мікрофотографіях - 8000 разів. Показники збільшення на електронному мікроскопі пода­ються з точністю до ±5%.

Вимірювання розмірів клітин здійснювали на відбитому з негатива позитиві. Дуже малі структури (хлоросоми) вимірювали на збільшеному відбитку, враховуючи збільшення [10]. На позитиві проводили лінії розмітки, а негатив зберігали для виготовлення додат­кових відбитків. Роблячи виміри парелельно на відбитку, враховували помилки при ви­значенні фотографувального збільшення позитиву, при друкуванні яких може позначатися неточність кінцевих результатів вимірів. Крім цього, відбиток у процесі його опрацювання може трохи зменшуватись у розмірах (стискатися).

Для вимірювання великих об'єктів (клітин) користувалися точною калібрувальною лінійкою з поділками 0,5 мм. Для вимірювання дрібних деталей користувалися спеціальним вимірювачем зі збільшувальним склом і сіткою.

Результати досліджень і їхнє обговорення

Дослідження морфології клітин фототрофних зелених сіркобактерій з використанням електронної мікроскопії показали, що виділені з водойм Яворівського родовища мікроорганізми були паличкоподібні - від прямих до зігнутих, розміром 1100-3000х4000-30000 А. Хлоросоми, які містили фотосинтезувальні пігменти, були еліпсоподібної форми, їхні розміри становили 350-650х900-1900 А (рис. 1). Розмноження відбувалося бінарним поділом. Клітини бактерій залишалися прикріпленими одна до одної, утворюючи ланцюжки, покриті слизом. Нерухомі. За Грамом зафарбовувались негативно. Спор не утворювали. Колонії фототрофних сіркобактерій були темно-зеленого кольору.

Показано, що досліджуваний штам містить як запасну речовину глікоген [4].

Досліджували здатність клітин зелених сіркобактерій C. limicola 1MB К-8 акумулю­вати іони важких металів за наявності різних концентрацій солей важких металів у сере­довищі. Результати наших досліджень показали, що у клітинах контрольних зразків іонів досліджуваних важких металів не виявлено (рис. 2-4).

За умов інкубування клітин у середовищі з кадмій сульфатом найінтенсивнішу аку­муляцію іонів металу спостерігали за концентрації 0,5 мМ протягом трьох годин. Найбіль­шу кількість іонів Кадмію (0,37±0,06х10-10 ммоль/г клітин) клітини C. limicola 1MB K-8 акумулювали на другу годину. За високих концентрацій (1,0-2,5 мМ) солі металу акумуля­ція іонів металу клітинами не виявлена (рис. 2).

Можливо, це зумовлено функціонуванням системи викачування іонів металу з клітини, що є захисною реакцією за цих умов, як це показано для S. aureus [15].

I. Кушкевич, С. Гчатуш, О. Кулачковський ISSN 0206-5657. ВісникЛьвівського університету. Серія біологічна. 2011. Випуск56

Рис. 1. Клітини C. limicola 1MB K-8, вирощені у середовищі GSB: ХЛ- хлоросоми; ГЛ - глікоген (електронна мікроскопія, х 8 000).

о

-

ті

=

=' =

о

0,42 І 0,35 І 0,28 і: 0,21 §0,14 1 0,07 0

З Контроль ] 0,5 мМ |1,0мМ 11,5 мМ |2,0мМ 2,5 мМ

1 2 З

Тривалість інкубування, год

Рис. 2. Акумуляція іонів Кадмію клітинами C. limicola 1MB K-8 за впливу CdSO4

Акумуляція Cu2+ досліджуваними бактеріями C. limicola 1MB К-8 зростала зі збіль­шенням концентрації солі металу в середовищі інкубування, але за впливу 2,5 мМ змен­шувалася протягом трьох годин (рис. 3). Максимум акумуляції Cu2+ (0,10±0,02 ммоль/г клі­тин) спостерігали на першу годину за найвищої досліджуваної концентрації CuSO4.

Акумуляцію іонів Плюмбуму визначено лише за 1,5-2,5 мМ металу в середовищі. Бактерії C. limicola 1MB K-8 акумулювали 3,69±0,42х10~8 ммоль/г клітин Pb2+ на другу го­дину (рис. 4).

Акумуляцію іонів Плюмбуму, як назовні, так і всередині клітини, виявлено і у бак­терій P. fluorescens [12, 13]. Можливо, за низьких концентрацій іони Плюмбуму та Купруму інтенсивно викачувалися із клітини специфічними системами, а за високих - їх активність була пригнічена, в результаті чого іони металу надходили у клітину, зв'язуючись із її ком­понентами. Є дані про вплив іонів Купруму на мембранні №+ЛС+-АТФази, на структуру та функції нуклеїнових кислот, синтез фосфоліпідів. При нестачі цього елемента пригні-

/. Кушкевич, С. Гчатуш, О. Кулачковський

ISSN 0206-5657. ВісникЛьвівського університету. Серія біологічна. 2011. Випуск56

0,12 п

Контроль

0,5 мМ 1,0 мМ 1,5 мМ 2,0 мМ 2.5 мМ

2 З Тривалість інкубування, год

Рис. 3. Акумуляція іонів Купруму клітинами С. limicola 1MB K-8 за впливу CuSO4

2 4,2 -

О

- І З'6 І 3'°

5 2,4 1;8-1,2 0,6

0'

*5

-

jКонтроль ] 0,5 мМ ] 1,0 мМ 11,5 мМ ]2,0 мМ 2,5 мМ

1

Тривалість інкубування, год

Рис. 4. Акумуляція іонів Плюмбуму клітинами С. limicola 1MB К-8 за впливу Pb(N03)2 чується обмін речовин, у першу чергу в результаті порушення активності купрумвмісних ферментів [16]. Відомо, що іони Купруму необхідні для життєдіяльності зелених сірко­бактерій. їх вносять у складі суміші мікроелементів середовища GSB (у перерахунку на концентрацію Cu2+ - 0,012 мМ) [18]. З наших експериментів очевидно, що досліджуваним зеленим сіркобактеріям С. limicola 1MB К-8 теж необхідний цей мікроелемент. Вони акуму­люють Cu2+ найінтенсивніше протягом першої години інкубування і, ймовірно, використо­вують його для залучення в активні центри ферментів. На другу-третю години акумуляція дещо зменшується, очевидно, через активацію транспортних систем, які здатні викачувати з клітини надлишок цих іонів. Система транспорту іонів Купруму та резистентність до ньо­го найкраще вивчена у грампозитивних патогенів Enterococcus hirae. У бактерій E. hirae сор-оперон міститься у хромосомі та складається із чотирьох генів: copY, copZ, copA і copB. Гени, які контролюють поглинання і викачування іонів Купруму (сорА і сорВ, відповідно), виявлено в одному опероні. У ціанобактерій роду Synechococcus гени АТФ-аз поглинання і викачування іонів Купруму є роз'єднаними. CtaA АТФ-аза поглинання іонів Купруму в ціанобактерій розміщена у клітинній мембрані, PacS АТФ-аза викачування - у тилакоїдних фотосинтезувальних мембранах. У бактерій роду Enterococcus система Cop регулюється вмістом іонів Купруму. Якщо концентрація Cu2+ у клітині є низькою, активується CopA АТФ-аза поглинання, а при надлишку цього металу - CopB АТФ-аза викачування. Надмір­на концентрація іонів Купруму спричиняє токсичний вплив на живі організми [5, 6, 9, 20].

Загалом, сорбція іонів металів здійснюється певними ділянками ліпополісахаридів клітинної стінки або специфічними хелатними сполуками, а можливо, визначається наявністю білка у клітинній стінці або поліфосфатами [8].

Оскільки клітини зелених сіркобактерій С. limicola 1MB K-8 здатні акумулювати Cu2+, Pb2+ та СсР+зі середовища, враховуючи дані літератури про вплив іонів важких металів на клітини, дослідили цитоморфологічні зміни в їхніх клітинах за внесення солі Кадмію.

Електронно-мікроскопічними дослідженнями показано, що внесення кадмій суль­фату впливає на морфологію клітин зелених сіркобактерій С. limicola 1MB K-8 (рис. 5-9). За внесення 0,5 і 1,0 мМ CdSO4 порушується поділ, не контрастуються при фотографуванні та не помітні на зрізах хлоросоми, зменшується кількість глікогену у клітинах (рис. 5-6).

Збільшення концентрації солі Кадмію від 1,5 до 2,0 мМ викликало більш помітні зміни структури цитоплазматичної мембрани та її відшарування від клітинної стінки. Ци­топлазма за цих умов ущільнена. Внесення 2,0 мМ CdSO4 спричинило зміну структури хлоросом: вони набули темного забарвлення, зменшились удвічі в розмірах, а деякі стали непомітними (рис. 7-8).

Продовжують нагромаджуватись електроннощільні утворення. Можливо, таке почорніння хлоросом обумовлено нагромадженням у цих фотосинтезувальних структурах іонів Кадмію, внаслідок чого відбувається порушення процесів фотосинтезу.

Подальше збільшення концентрації солі Кадмію до 2,5 мМ спричинило руйнування ланцюгоподібних угрупованнь клітин С. limicola 1MB K-8 (рис. 9).

Вони стали поодинокими, більш округлими, набули форми, не характерної для бактерій цього роду. Також за цих умов порушувалися процеси поділу клітин бактерій.

Таким чином, внесення кадмій сульфату спричиняє цитоморфологічні зміни клітин фотосинтезувальних зелених сіркобактерій С. limicola 1MB K-8.

Клітини зелених сіркобактерій Ghlorobium limicola 1MB K-8 здатні акумулювати зі середовища іони Cu2+, Pb2+ та Cd2+. Акумуляція іонів важких металів залежить від концен­трацій їхніх солей у середовищі. Максимальна акумуляція іонів Купруму досягається за концентрації його солі в середовищі 2,5 мМ на першу годину інкубування, Плюмбуму - при 2,5 мМ на другу годину інкубування, а акумуляція іонів Кадмію відбувається за наявності

Рис. 5. Клітини С. limicola 1MB K-8, вирощені Рис. 6. Клітини С. limicola 1MB K-8, вирощені в середовищі за впливу 0,5 мМ кадмій в середовищі за впливу 1,0 мМ кадмій

сульфату (електронна мікроскопія, х 8 000). сульфату (електронна мікроскопія, х

8 000).

Рис.  7.  Клітини  С.   limicola 1MB  K-8, Рис. 8. Клітини С. limicola 1MB K-8, вирощені в

вирощені в середовищі за впливу середовищі за впливу 2,0 мМ кадмій сульфату

1,5 мМ кадмій сульфату (електронна (електронна мікроскопія, х 8 000). мікроскопія, х 8 000).

(електронна мікроскопія, х 8 000).

0. 5 мМ CdSO4 на другу годину. Враховуючи результати досліджень, фототрофні зелені сір­кобактерії С. limicola 1MB К-8 можна розглядати як перспективні для розроблення спосо­бів очищення води не лише від H2S, а й від іонів Купруму.

Цитоморфологічні зміни фотосинтезувальних зелених сіркобактерій Ghlorobium limicola 1MB К-8 підтверджують дані літератури про негативний вплив іонів важких мета­лів на клітини мікроорганізмів.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Баран L, Кушкевич L, Гнатуш С., Гудзъ С. Систематичне положення, фізіолого-біохімічні властивості та екологія зелених фототрофних бактерій // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. 2007. Вип.43. С. 48-60.

2. Баран І., Мороз О., Гудзъ С., Гнатуш С. Метаболізм органічних сполук у зелених фототрофних сіркобактерій та утилізація ними сірководню // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. 2003. Вип. 33. С. 132-140.

3. Гайдін А. М., Зозуля І. І. Яворівське озеро / Львів: ВАТ «Інститут гірничо-хімічної промисловості», 2007. 70 с.

4. Горішний М. Б. Екологічне значення зелених сіркових бактерій в утилізації сірковод­ню: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. К., 2008. 20 с.

5. 1утинсъка Г. О., Петруша З. В., Василъева Т. В., Сопліна О. М.Токсичність і мутаген­ність важких металів - забруднювачів грунту // Современные проблемы токсикологии. 2000. №№ 2. С. 53-56.

6. Кушкевич І. В. Вплив солей важких металів на фізіолого-біохімічні характеристики бактерій циклу сірки: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. К., 2010. 20 с.

7. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

8. Подгорский В. С., Касаткина Т. П., Лозовая О. Г. Дрожжи - биосорбенты тяжёлых металлов // Мікробіол. журн. 2004. Т. 66. № 1. С. 91-103.

9. Таширев А. Б., Смирнова Г. Ф. Аккумуляция металлов синтрофными ассоциациями микроорганизмов // Мікробіол. журн. 1999. Т. 61. № 6. С. 58-65.

10. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Мир, 1975. 314 с.

11. ХоултДж., Криг Р., СнитП. и др. Определитель бактерий Берджи. М.: Мир, 1997. Т. 1. 426 с.

12. Aickin R. MLead accumulation by Pseudomonas fluorescens and a Gtrobacter sp. // Micro-biosLett. 1979.N9. Р. 55-66.

13. Al-Aoukaty A., Appanna V.D., //uang/.Exocellular and intracellular accumulation of lead in Pseudomonas fluorescens ATCC 13525 is mediated by the phosphate content of the growth medium // FEMS. Microbiol. Lett. 1991. Vol. 83. P. 283-290.

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

І Кушкевич - Акумуляція іонів важких металів клітинами chlorobium limicola 1mb k-8 та їхні цитоморфологічні зміни за впливу кадмій сульфату

І Кушкевич - Вплив різних концентрацій pb2+ на фізіолого-біохімічні властивості фототрофних сіркобактерій chromatium okenii