Автор неизвестен - В поисках экологии черноморских вирусов - страница 1

Страницы:
1  2 

МОРСЬКИЙ ЕКОЛОГІЧНИЙ ЖУРНАЛ

РЕЦЕНЗИИ

В ПОИСКАХ «ЭКОЛОГИИ ЧЕРНОМОРСКИХ ВИРУСОВ»

Рец. на кн. О. А. Степановой «Экология аллохтонных и автохтонных вирусов Чёрного моря». - Киевский нац. унив-т им. Тараса Шевченко. - Севастополь: Мир, 2004. - 306 с.

Тема, вынесенная в заголовок монографии О. А. Степановой - «Экология аллохтонных и авто­хтонных вирусов Чёрного моря» -, весьма актуаль­на, однако актуальность тематики не всегда являет­ся гарантией высокого качества и значимости ре­зультатов исследования, что наглядно демонстриру­ет рецензируемая работа. Она вобрала в себя, пожа­луй, весь спектр недопустимых ошибок и недорабо­ток, которые могут встретиться в исследователь­ской практике: от некомпетентности в вопросах методологии исследований и непонимания осново­полагающих концепций и терминологии до неспо­собности грамотно организовать эксперименталь­ную работу, сделать правильные выводы из полу­ченных результатов и ясно изложить их на бумаге. Объём работы, которую пришлось выполнить ре­цензентам монографии, оказался столь велик, что мы были вынуждены акцентировать внимание лишь на ряде наиболее существенных вопросов (в первую очередь, методах исследования, см. ниже п. 4), не­которые из них иллюстрировать яркими примерами, большую же часть оставить без внимания. К тому же, пришлось отказаться от традиционного рас­смотрения содержания глав монографии в порядке их изложения в пользу системного анализа всей работы, который приводит, увы! к неутешительно­му для автора выводу: большая часть полученных им данных не отвечает критериям достоверности.

1. Отсутствие целостности исследования, несоответствие содержания монографии заяв­ленному названию. Попытка автора объединить свои результаты некоторой общей идеей свелась к выбору обобщающего названия. Однако «экология» вирусов Чёрного моря в понимании О. А. Степано­вой - это гелиогеофизические факторы, ультрафио­летовая «нагрузка», превышающая естественный фон в порядки раз, содержание нуклеиновых кислот в среде, превышающее природные концентрации в порядки раз (см. ниже). В монографии предпринята попытка (гл. 4) объяснить динамику численности бактерио- и вириопланктона, изменения в их мор­фологии и в метаболической активности бактерио­

Морський екологічний журнал, № 4, Т. VI. 2007

планктона фазами Луны, продолжительностью све­тового дня и геомагнитной напряжённостью. Такие же факторы, как содержание органического вещества и биогенов в воде (т.е. источников углерода и энер­гии, определяющих физиологическую активность микроорганизмов и продуктивность сообщества), трофические процессы в микробиальной пищевой цепи (в частности, смертность микроорганизмов вследствие их выедания консументами), естествен­ные процессы потери вирулентности и разрушения вирусных частиц в толще воды (как один из процес­сов, определяющих численность вирусов in situ) и многие другие, автором вовсе игнорируются: они исключены из полевых исследований и эксперимен­тов, не рассматриваются в ходе анализа и обсужде­ния полученных результатов. Позабыт автором и главный процесс, в котором, собственно, заключена экологическая значимость вирусов в водных экоси­стемах, - смертность планктонных и бентосных ор­ганизмов в результате их инфицирования вирусами.

2. Несоответствие литературного обзора направлениям исследования. Результаты, которые изложены в главах 2, 4, 7 и 9, не соотнесены в пол­ной мере с ранее известными и опубликованными данными. В частности, литературный обзор (гл. 1) не содержит исчерпывающей информации о воз­можности межвидовой трансмиссии бактериофага со сменой прокариотного хозяина эукариотным и методах идентификации этого процесса (к результа­там гл. 2.4); интенсивность дыхания бактерио-планктона (для сопоставления с результатами мик­рокалориметрии, представленными в гл. 4.3, табл. 4.12); энергетических аспектах взаимодействия фа­гов и бактерий в ходе литической инфекции (к ре­зультатам гл. 7.2); влиянии лунных фаз и геомаг­нитной напряженности на численность и физиоло­гическую активность гидробионтов (к результатам гл. 4.3); физические и химические основы контакта и «взаимодействия» (терминология автора., стр. 252 - 259) вируса с растворённой в водной среде ДНК и предпосылках к использованию микрокалоримет­рии в исследовании этого процесса.

Столь неуважительное отношение к публи­кациям коллег автор оправдывает смелостью своих идей, примеряя при этом образ «первооткрывателя» новых направлений в исследованиях морских виру­сов: «Вполне возможно, что наши работы в пред­ставленном направлении выполнены впервые, а выводы, сделанные на основании результатов, не­ожиданны и слишком смелы, т.к. не имеют опоры и поддержки в виде ссылок на иные публикации»

(стр. 204).

Подобный подход, однако, может свиде­тельствовать лишь о некомпетентности автора в тех самых областях знаний, в которых она и проводит свои исследования.

3. Неточности цитирования и искажение содержания ссылок. Монография переполнена ссылками на публикации, содержание которых ав­тор или понимает неверно, или умышленно искажа­ет, чтобы обосновать необходимые положения (в том числе, для оправдания применения устаревших и несуществующих методов - см. ниже п. 4). Одно­временно фактически проигнорированы работы, без которых понимание той или иной проблемы будет неполным. Несколько тому примеров в одной лишь из тем, затронутых в монографии: микроскопии мельчайших организмов планктона.

На стр. 53 - 57 автор делает обзор методов количественного исследования вирусов в водных экосистемах. Концептуальная статья Дж. Сибурта с соавторами (Sieburth et al., 1978) представлена как «одна из первых работ, посвящённых изучению фракций морского микропланктона при помощи трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) с выделением фракции фемтопланктона...» (стр. 53). Однако, цитируемая публикация является теоретиче­ской работой и не содержит описания каких-либо методов, включая ТЭМ.

Говоря об эпифлуоресцентной микроско­пии (ЭФМ), автор рецензируемой монографии ад­ресует читателя к источникам, в которых приводят­ся «особенности использования ЭФМ для прямого счёта бактерий и вирусов, требования к размерам пор фильтров, описания разнообразных флуорохро-мов» (стр. 55), а именно: Родина (1965), Hobbie et al. (1977), Stockner et al. (1990), Suzuki et al. (1993), Wommack, Colwell (2000). Однако ни одна из этих работ не содержит описания метода прямого счёта вирусов в пробах воды с помощью ЭФМ.

Автор сообщает о сопоставимости резуль­татов счёта вирусов, получаемых с помощью ЭФМ и ТЭМ, ссылаясь на статью Borsheim et al. (1990) (стр. 55). Однако в этой работе ЭФМ применяли только для счёта бактериопланктона, тогда как ви-риопланктон исследовали с помощью ТЭМ. Следо­вательно, упомянутое сопоставление результатов ТЭМ и ЭФМ было невозможно.

О. А. Степанова пишет, что Hara et al. (1991) концентрировали вириопланктон на миллипоровые фильтры (стр. 56), но, увы! они применяли для этих целей трековые (ядерные) мембраны с диаметром пор 0.015 мкм, а миллипоровые мембраны (с диа­метром пор 0.45 мкмк) использовали в качестве подложки для равномерного распределения вакуума по поверхности трековой мембраны.

Со времени опубликования упоминаемой в монографии О. А. Степановой работы Hara et al. (1991), в которой была предпринята первая попытка количественного учёта фемтопланктона с помощью ЭФМ, технология концентрирования сообщества претерпела серьёзные изменения с появлением мембран Anodisc 25 (Whatman International Ltd.), сменились два поколения флуорохромов - от DAPI (Suttle, 1993) к Yo-Pro-1 (Weinbauer & Suttle, 1997), SYBR Green I (Noble, Fuhrman, 1998) и SYBR Gold (Chen et al., 2001), были усовершенствованы методы фиксации проб и их хранения (Wen et al., 2004).

Ни одна из этих работ не упоминается в монографии. Если причина этого - неосведомлён­ность её автора, то - как объяснить тот факт, что неоднократно цитируемый в монографии обзор Wommack, Colwell (2000) содержит информацию о Yo-Pro-1 и SYBR Green I?

4. Несоответствие методологии исследо­вания поставленным задачам. Применение уста­ревших и несуществующих методик.

4.1. Микроскопия вириопланктона. Обосновывая применение ЭФМ для счёта морских вирусов, О. А. Степанова ссылается на пособие К. А. Макирова (1974), в котором, по её словам, описаны возможности люминесцентного микроскопа МЛ-2 «для обнаружения отдельных вирусов» (стр. 123). Однако в этой работе (Макиров, 1974, стр. 137) речь идёт о выявлении: а) «элементарных телец крупных вирусов, размеры которых превышают 150 під», тогда как более 65 % морских вирусов имеют раз­мер капсида в диапазоне от 30 до 60 нм (Hennes, Simon, 1995; Weinbauer, Peduzzi, 1994); б) «внутри­клеточных вирусных включений», которые не яв­ляются отдельными вирусами. Кроме того, в посо­бии не обсуждается применение мембран для кон­центрирования проб, не приводится подробное опи­сание методов.

О. А. Степанова пытается показать, что ме­тод, который она использовала для оценки числен­ности вирусов с помощью ЭФМ, давно применяется в морской микробиологии, тем самым вводя чита­теля в заблуждение.

Читаем на стр. 125: «Подсчёт вирусов (нафильтрах с диаметром пор 0,05 и 0,01 мкм), а также и бактерий (на фильтрах с диаметром пор 0,45 и 0,2 мкм) осуществляли по общепринятой методике [Ро­дина, 1965; Hara et al., 1991; Hobbie et al., 1977; Su­zuki et al., 1993]». Среди цитируемых ею публика­ций лишь одна (Hara et al.,1991) содержит описание метода ЭФМ, пригодного для счёта ДНК-содержащих частиц в фемтопланконе, который, впрочем, уже устарел и более не используется в современных исследованиях. Однако и этот метод О. А. Степановой не применялся, поскольку вместо DAPI и трековых мембран, о которых говорится в публикации Hara et al. (1991), она использовала ак-ридиный оранжевый (АО) и белые нитроцеллюлоз-ные.

Заметим, что до О. А. Степановой никто не использовал АО и нитроцеллюлозные мембраны в подобных целях: «т.к. нам не встречалась информа­ция по использованию для окрашивания водных вирусов АО, то наши публикации являются первы­ми по описанию эффективности применения этого флуорохрома в водной вирусологии») (стр. 124). Можно было бы считать О. А. Степанову «новато­ром», но лишь с той лишь оговоркой, что она при­меняла эти материалы в исследованиях вирио-планктона и вириобентоса без соответствующей методологической базы.

Причина, по которой другие исследователи не додумались до подобного «новаторства», заклю­чается в следующем.

Во-первых, белые нитроцеллюлозные мем­браны - источник интенсивной фоновой автофлуо­ресценции даже после их чернения иргаланом (Dalley, Hobbie, 1975; Jones, 1979). Вследствие этого контраст изображения настолько мал, что распозна­вание окрашенных флуорохромами микроорганиз­мов становится трудноосуществимым.

Во-вторых, неспецифическая окраска детри­та и клеточных структур, которая свойственна АО (Porter, Feig, 1980), и о которой говорит сама О. А. Степанова (стр. 123), может быть источником арте­фактов. К этому следует добавить, что для чернения нитроцеллюлозных мембран автор использовала спирторастворимый краситель Судан чёрный, но нитроцеллюлоза чувствительна к действию боль­шинства растворителей, в том числе спиртовых (Brock, 1983, см. также техдокументацию к мембра­нам Sartorius). В ходе чернения мембрана должна выдерживаться в красителе в течение нескольких часов. Если материал мембраны - нитроцеллюлоза, её структура и фильтрационные свойства будут на­рушены. О. А. Степанова же использовала такие мем­браны для оценки численности как бактерий, так и вирусов.

К сожалению, автор демонстрирует также и непонимание элементарных основ микроскопии. В монографии приведены описания «геометрических («морфологических») форм представителей черно­морского виропланктона, которых наблюдали при ЭФМ» (стр. 124), т.е. автор описывала «морфоти-пы» морских вирусов с помощью светового микро­скопа. «Мы отличали по форме округлые (сфериче­ские), палочковидные, лимоноподобные (игловид­ные) и волосковидные вирусные частицы» (стр. 124). Автор утверждает, что этим описаниям со­звучны «упрощенные характеристики морфологии вирусов», приводимые в пособии К.А. Макирова (1974): «по внешним признакам вирусы подразде­ляются на сферические (шаровидные), палочковид­ные (нитевидные) и сперматоподобные» (Макиров, 1974, стр. 125). Однако описания, которые приводит К. А. Макиров, получены с помощью электронной микроскопии, а не ЭФМ.

4.2. Выделение и микроскопия бактерио-и вириобентоса. Метод, который автор рецензи­руемой монографии использовала для выделения микроорганизмов бентоса, заключался в приготов­лении суспензий донных осадков в физиологиче­ском растворе, их встряхивании (собственно, смыв бактерий и вирусов с частиц взвеси) и отстаивании для проведения микроскопии надосадочной жидко­сти. Каких-либо ссылок на работы, в которых дан­ная методика описана подробно, она не приводит. Её подход не имеет ничего общего с современным методом экстрагирования бактерий и вирусов из донных осадков (см. Danovaro et al., 2001; Glud, Middelboe, 2004; Bettarel et al., 2006), высокая эф­фективность которого основана на действии ПАВ (пирофосфата натрия), ультразвуковой обработке и центрифугировании проб.

Микроскопия экстрагированных из донных осадков бактерий и вирусов (Danovaro et al., 2001; Glud, Middelboe, 2004; Bettarel et al., 2006) подразу­мевает использование упомянутых выше материа­лов (мембраны Anodisс 25, флуорохромы SYBR Green I или SYBR Gold), а также обработку проб нуклеазами для разрушения внеклеточных нуклеи­новых кислот и снижения их фоновой флуоресцен­ции (Danovaro et al., 2001). Однако О.А. Степанова не использовала ни один из этих методов, что за­ставляет сомневаться в достоверности полученных ею данных о численности вирусов и бактерий в бентосе.

4.3. Контаминация гидробионтов аллох-тонными вирусами. О.А. Степанова пишет, что в бухтах Севастополя в 1994 - 1997 гг. ею «. были изучены 34 сообщества мидий, 10 из которых были контаминированы адено-, энтеро-, рота- и реовиру-сами, что составляет около 30 % от общего количе­ства исследованных сообществ» (стр. 97). Более ничего конкретного о встречаемости вирусов в ми­диях не сообщается. В работе отсутствуют данные не только о частоте встречаемости тех или иных групп вирусов в исследованных пробах мидий («со­обществах», по терминологии автора), но и об об­щей доле инфицированных моллюсков в отдельно взятой пробе. Однако только на основании таких данных можно сделать вывод об общей инфициро-ванности черноморских мидий. Автор лишь указы­вает, что «. чаще были инфицированы особи сред­них размеров (25 - 45 мм длины) по сравнению с более мелкими или крупными представителями, что вероятно связано с их физиологическим особенно­стями» (стр. 112). Что понимать в научной публи­кации под словом «чаще» - непонятно, поскольку никаких цифр автор не приводит. И совершенно неясно, что имела в виду О. А. Степанова, говоря о физиологических особенностях моллюсков разных размеров, и как это связано с их инфицированием, т. к. это утверждение никак не комментируется. Бо­лее того, непонятен сам принцип разделения мол­люсков на «пулы» (?!) из особей крупного (4.5 х 2.5 см), среднего (4.5 - 2.5 х 2.5 - 2 см) и малого (так у автора!) (менее 2.5 х 1.5 см) размеров, т.к. хорошо известно, что мидии одного и того же возраста мо­гут иметь разный размер, а потому отождествлять возраст и размеры, как это делает автор на стр. 92, никак нельзя.

Судя по материалам табл. 2.4 (стр. 95 - 96), взятие проб мидий из Севастопольских бухт носило случайный характер, не учитывались глубина места взятия проб и его удалённость от источника посту­пления сточных вод, полностью отсутствовал круг­логодичный ряд наблюдений, выполняемых хотя бы на одной станции. К тому же в большинстве случаев пробы мидий были представлены какой-либо одной размерной группой из числа, выделенных автором, - или 0, или 1, или 2. Единственный раз, в июле 1995 г., проба мидий из Артиллерийской бухты бы­ла представлена всеми тремя размерными группами (0, 1 и 2), и один раз, в июне 1995 г., в Камышовой бухте - двумя (2 и 3). На основании таких фрагмен­тарных материалов сделать обоснованные выводы об экологии вирусов невозможно.

Хорошо известно, что встречаемость энте-ровирусов в моллюсках, в том числе в мидии, зави­

сит от их циркуляции в сообществе людей, а также от многих других биотических и абиотических фак­торов. По этой причине она подвержена сезонным и межгодовым колебаниям, пространственной измен­чивости, что необходимо учитывать при анализе роли моллюсков в «возвращении» вирусов в чело­веческое общество. Только располагая такой ин­формацией можно судить о роли мидий в циркуля­ции патогенных для человека вирусов в любом во­доёме, в том числе и в Чёрном море.

4.4. Применение микрокалориметрии в исследовании бактериопланктона. Результаты, полученные автором в микрокалориметрических экспериментах с бактериопланктоном, представле­ны в табл. 4.12 (стр. 159), как общая теплопродук­ция пробы (мкВт) и интенсивность теплопродукции бактерий (мкВт 10-5 кл.). В соответствии с этими данными, интенсивность теплопродукции планк­тонных бактерий изменялась в диапазоне от 0.04 до 3.25 мкВт 10-5 кл., что эквивалентно 0.4 - 32.5 пВт кл.-1 (п = пико = 10-12) и в среднем на 3 порядка выше величин скорости дыхания морского бактериопланк-тона, полученных ранее разными исследователями. Например, интенсивность дыхания сообщества в океанических водах составляла 0.4 - 8.7 фмоль О2 кл.-1 сут.-1 (Biddanda et al., 1994; Blight et al., 1995), что эквивалентно 2.1 - 45.2 фВт кл.-1 (ф = фемто = 10-15), если принять оксикалорийный коэффициент равным -450 кДж моль-1 О2 . Можно обратиться и к отечественным данным, в соответствии с которыми интенсивность дыхания бактериопланктона в Сева­стопольской бухте составляла 0.18 - 0.41 x 10-12 г О2 кл.-1 сут.-1 (Шумакова, 1987), что эквивалентно ин­тенсивности теплопродукции 29.3 - 66.7 фВт кл.-1.

Простейшие вычисления показывают, что при численности бактерий в морской воде 106 кл. мл-1 и объёме исследуемой пробы 3 мл суммарная теплопродукция пробы не может превысить порог чувствительности микрокалориметра ВАМ-2277, который О. А. Степанова использовала в своих ис­следованиях. Это означает, что, как и в случае с микроскопией, микрокалориметрические данные, представленные в монографии, не соответствуют действительности.

4.5. Применение микрокалориметрии в исследовании взаимодействия бактерий и фагов. В микрокалориметрических экспериментах с мо­дельной системой «фаг-бактерия» О. А. Степанова использовала вирулентные фаги. Следовательно, при возрастании кратности заражения (MOI, multi­plicity of infection) выше некоего предела должен происходить полный лизис бактериальной культуры с соответствующими изменениями в оптическойплотности и теплопродукции культуры. Однако, ни в одном из многочасовых экспериментов, результа­ты которых представлены в гл. 7.2, подобной кар­тины не наблюдалось. Более того, О.А. Степанова получила микрокалориметрические свидетельства «бурного роста» инфицированной культуры Xan-thomonas (стр. 223 - 227) и делает на их основе сле­дующее заключение: «изученные вирусные изоляты не могут быть использованы в качестве биологиче­ского средства против возбудителя туберкулёза са­харной свеклы (X. axanopodis pv. beticola), т.к. в конечном итоге потенцируют рост бактериальной культуры» (стр. 226 - 227). Возникает вопрос: как могло случиться, что штамм 7325 бактериофагов фитопатогенных бактерий из коллекции кафедры вирусологии КНУ, предназначенных для борьбы с заболеваниями с/х растений, стал, в соответствии с выводами автора монографии, потенциально опас­ным для сельского хозяйства страны? Если проис­хождение штамма сомнительно, автору не следова­ло включать в монографию результаты, которые она получала с его помощью, в частности, гл. 2.3, 2.4, часть гл. 7.2 (микрокалориметрию взаимодействия Xanthomonas со штаммом фага 7325), часть гл. 9 (микрокалориметрию штамма 7325 с ДНК).

Идея исследования системы «фаг-бактерия» микрокалориметрическим методом хоть и не нова, но, несомненно, перспективна. Можно лишь сожа­леть, что ценность результатов, представленных в гл. 7.2, невелика по причине: а) отсутствия калиб­ровок кривых оптической плотности, которые бы позволили перейти от относительных единиц к чис­ленности бактерий в культуре и, как одно из след­ствий этого, б) отсутствия информации об интен­сивности метаболизма бактерий (пВт кл.-1) на про­тяжении экспериментов; в) отсутствия точной ин­формации о том, какие величины MOI были заданы в представленных экспериментах; г) недостаточного количества вариантов MOI в экспериментах с каж­дой парой фаг-бактерия; д) недостаточного количе­ства повторных микрокалориметрических экспери­ментов; е) отсутствия контроля процесса инфици­рования методами микроскопии.

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

Автор неизвестен - 13 самых важных уроков библии

Автор неизвестен - Беседы на книгу бытие

Автор неизвестен - Беседы на шестоднев

Автор неизвестен - Богословие

Автор неизвестен - Божественность христа