Автор неизвестен - Анатолій якович циганенкодо 75-річчя від дня народження - страница 19

Страницы:
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50 

русные частицы имеют липопротеидную обо-

Таблица 1. Результаты выявления инфекционной активности вирусов,

хранившихся при -18 °С

Название вируса

Название штамма

Дата замораживания

Продолжительность хранения,лет

Выявление инфекц. активности

 

 

10.03.87

15

-

 

М-87

04.09.87 05.02.01

14 1

+

ПГ-3

 

02.04.01

1

+

 

ЗКСМ

08.06.89 21.03.03

11

0,25

+

 

SF-4

05.11.82

8,70

 

вд

«Oregon C-24V*

29.12.02 08.02.92

0,25 10

+

 

УНДІЕВ-25

06.02.92

10

+

Примечание. (+) — выявлена; (-)

не выявлена.

Таблица 2. Сравнительная оценка титров инфекционной активности в образцах с выявленной инфекционностью после хранения при -18

Название вируса

Название штамма

Продолжительность хранения, годы

Исходная инфекц. активность, lg ТЦДб0Лія

Инфекц. активность, І8ТЦД60/Ш

ПГ-3

М-87

1 1

5,0±0,2 5,0±0,2

0 0

 

ЗКСМ

0,25

4,0±0,2

3,5±0,2

вд

«Oregon C-24V*

0,25 10

7,0±0,2 7,0±0,2

6,33±0,3 4,33±0,3

 

«УНДІЕВ-25»

10

6,0±0,2

3,77±0,3

Примечание. ТЦД50/мл тканевая цитопатическая доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % культур клеток.

Рис. 1. Электронограмма (тонкий срез) вируса ПГ-3:

а вирионы имеют форму неправильных сфер размером 130-170 нм; хорошо видны пепло-меры на липопротеидной оболочке вирионов, наблюдаются и разрушенные вирусные части­цы; б полиморфные вирионы размером 150-240 нм. Кроме цельных вирионов, наблюдают­ся вирионы с повреждениями липопротеидной оболочки

лочку с хорошо заметными пепломерами. Кроме цельных вирионов, на электронограм-мах ясно определяются вирионы с поврежден­ной липопротеидной оболочкой.

На электронограммах вируса диареи (рис. 2, а и б) обнаруживаются вирусные частицы мень­ших, чем вирусные частицы ПГ-3, размеров (40-70 нм). Они имеют сферическую форму, не­которые расположены в виде агрегатов (скопле­ний). Заметных повреждений липопротеидной оболочки вирионов не выявлено.

Подводя итоги, отмечаем корреляцию сни­жения инфекционной активности при увели­чении сроков хранения вирусных суспензий.

Рис. 2. Электронограмма вируса диареи размером 40-70 нм: а вирусные частицы; б вирусные скопления

б

а

В вирусном материале ПГ-3 и ВД, хранив­шемся от одного года и более, не удалось обна­ружить структурно обособленных вирионов при электронно-микроскопических исследованиях.

Выводы

На электронограммах вирусов ПГ-3 обна­ружены повреждения суперкапсидных оболо­чек вирионов, что указывает на большую хрупкость этой структуры и меньшую ее крио-устойчивость по сравнению с вирусом диареи.

Длительное хранение исследованных ви­русных суспензий при -18 °С не обеспечива­ет сохранности их биологической активности и ультраструктуры на исходном уровне. По­этому данный режим консервирования мо­жет использоваться для временной, непро­должительной стабилизации вирусного мате­риала.

Список литературы

1. Актуальные проблемы криобиологии. Под общ. ред. Н.С. Пушкаря и А.М. Белоуса. К.: Наук. думка, 1981. 608 с.

2. Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология. К.: Наук. думка, 1994. 432 с.

3. РахимоваЕ.Л., ИваницаВА. Влияние различных способов хранения микобактерий на их жиз­неспособность. Мікробіол. журн. 2001; 63, 6: 3-7.

4. ЛярскиЗ. Диагностика вирусных болезней животных. Пер. с польск. Т.Г. Орловой и Я.С. Ляндс-берга; Под ред. В.Н. Сюрина. М.: Колос, 1980: 139-141.

5. Karl Habel, Norman P. Salzman. Fundamental Techniques in Virology. Методы вирусологии и молекулярной биологии. Пер. с англ. Л.Б. Меклера. М.: Мир, 1972: 410-426.

ВПЛИВ ТРИВАЛОСТІ ЗБЕРЕЖЕННЯ ВІРУСІВ В УМОВАХ ПОМІРНО НИЗЬКИХ ТЕМПЕРАТУР НА ЇХ УЛЬТРАСТРУКТУРУ І БІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ М.Ю. Стегній

Шляхом порівняльного вивчення біологічної активності, морфології й ультраструктури вірусів парагрипу і діареї великої рогатої худоби, що піддавалися заморожуванню, довгостроково і коротко­часно зберігалися при -18 °С, показано, що тривале збереження досліджених вірусних суспензій не забезпечує схоронності їхньої біологічної активності й ультраструктури на вихідному рівні. Тому даний режим консервування може використовуватися для тимчасової, нетривалої стабілізації вірусного матеріалу.

Ключові слова: віруси парагрипу, віруси діареї, збереження, помірно низькі температури.

INFLUENCE OF DURATION OF STORAGE IN CONDITIONS OF MODERATE-LOW TEMPERATURES ON ULTRA STRUCTURE AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF VIRUSES M.Yu. Stegniy

By comparative study of biological activity, morphology and ultra structure of viruses parainfluenza and diarhhea of large horned cattle exposed to freezing, a long time and a little time stored at -18 °C is shown, that the long storage investigated virus suspensions does not provide safeties of their biological activity and ultra structures at an initial level. Therefore given regimen of preservation can be used for temporary, short stabilization of a virus material.

Key words: virus parainfluenza, virus diarhhea, storage, moderate-low temperatures.

ГЕНОТИПУВАННЯ ГОСПІТАЛЬНИХ ШТАМІВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBSP. AUREUS ЗА ДОПОМОГОЮ АНАЛІЗУ ПОЛІМОРФІЗМУ ДОВЖИНИ ФРАГМЕНТІВ РЕСТРИКЦІЇ ХРОМОСОМНОЇ ДНК

О.М. Тимченко

Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України, м. Харків

Проведено епідеміологічне, внутрішньовидове типування 17 штамів Staphylococcus au-reus subsp. aureus — збудників госпітальних інфекцій методом аналізу поліморфізму дов­жини фрагментів рестрикції хромосомної ДНК. При здійсненні Sma I-ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК стафілококів виявлено 5 типів фінгерпринтів. Показано, що метод генотипування має ряд переваг перед традиційними методами фенотипування і може бути використаний в практиці боротьби з інфекційними захворюваннями. Ключові слова: Staphylococcus aureus, метод генотипування, рестрикція хромосомної ДНК, фінгерпринти, патерни.

Боротьба із госпітальними інфекціями залишається актуальною проблемою охорони здоров'я. Гнійно-запальні захворювання ста­філококової етіології є класичним прикладом госпітальних інфекцій [1-3]. У сучасній си­стемі епідеміологічного нагляду важливе міс­це відведено мікробіологічному моніторингу з проведенням ідентифікації та внутрішньо­видового типування штамів збудника гос­пітальних стафілококів — Staphylococcus spp. Для цього з середини 1980-х років все актив­ніше застосовуються методи генотипування, які ґрунтуються на визначенні прямим або опосередкованим способом відмінностей в первинній структурі геному мікроорганізмів (визначення плазмідного профілю, риботипу-вання, ПЛР-типування, фінгерпринтинг на основі гібридизації нуклеїнових кислот та ін.) [4, 5]. Найбільш доступним за простотою, уні­версальністю, дискримінантністю та від-творюваністю результату для широкого при­кладного застосування визнано метод аналізу поліморфізму довжини фрагментів рестрикції хромосомної ДнК (АПДфР ХрДНК), якому більшість дослідників відводять роль «золо­того стандарту» при епідеміологічному, внут­рішньовидовому типуванні мікроорганізмів різних таксономічних груп, у тому числі і ста­філококів [6, 7].

В даній роботі представлені результати епі­деміологічного, внутрішньовидового типуван-ня з використанням методу АПДФР ХрДНК 17 штамів S. aureus subsp. aureus (далі S. aureus), ізольованих від хворих і медичних працівників Лозівської районної лікарні (Харківська обл.) під час спалаху госпітальної інфекції в січні 1998 р.

Матеріал і методи. Досліджено 17 госпі­тальних штамів S. aureus, які за своїм поход­женням розподілені на три групи: 9 культур (№ 543, 548, 553, 555, 568, 569, 579, 581, 658) ізольовані в пологовому відділенні, 5 (№ 733, 743, 744, 751, 758) — у відділенні анестезії і реанімації, 3 (№ 276, 291, 295) — у ЛОР-від-діленні Лозівської районної лікарні. Як ета­лонний використовували штам S. aureus АТСС 25923, отриманий із музею мікроорга­нізмів Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України.

Типування культур проводили методом АПДФР ХрДНК із використанням пульс-елек-трофорезу за допомогою приладу «ПУЛЬС-ГЕФ 1» [8].

Для виділення і ендонуклеазної рестрик­ції хромосоми бактерій застосовували техніку розщеплення великих молекул ДНК в агароз-них блоках [9-11]. Приготування блок-вста­вок із ДНК хромосоми S. aureus виконували в модифікованому автором варіанті [10-13]. Для цього клітини із 50 мл LB-бульйонної культури стафілококів у логарифмічній фазі росту шляхом центрифугування (при 85 с-1 протягом 5 хв) відмивали в TEN-буфері (TEN-буфер включає 10 мМ трис-ОН із рН=7,5; 0,15 М NaCl; 0,1 М ЕДТА з рН=7,6), суспен­дували в 10 мл ЕС-буфера (ЕС-буфер включає 6 мМ трис-HCl із рН=7,6; 1 М NaCl; 100 мМ ЕДТА з рН=7,5; 0,5 % (об'єм/об'єм) бридж-58 фірми «Sigma Chemical Co»; 0,2 % (маса/ об'єм) дезоксихолату фірми «Sigma Chemical Co»; 0,5 % лаурилсаркозину натрію фірми «Ciba-Geigy»). 1,5 мл підігрітої до 40 °С суспензії змішували з аналогічним об'ємом 2%-вої низькоплавкої агарози INCERT фірми

FMC Со (виготовленої на ЕС-буфері та охолод­женої до 50 °С). За допомогою гребінок для електрофорезу фірми «Диа-М» готували агарозні блоки розміром 10х5х1 мм [10-13]. Агарозні блоки (по 10-12) кожного штаму S. aureus окремо вносили в 10 мл ЕС-буфера з 30 Од.акт./мл лізостафіну і 50 мкг/мл РНКази А. Інкубували при t=37 °С впродовж 10-14 год, повільно перемішуючи на шейкері. Розчин ЕС зливали, додавали 10 мл ESP-буфера (ESP-бу-фер включає 0,5 М ЕДТА з рН=9,3; 1 % лаурил-саркозину натрію, 1 мг/мл протеїнази К фірми «Sigma Chemical Co»), інкубували при 50 °С про­тягом двох діб, періодично перемішуючи суміш шляхом перевертання пробірок. Залишки протеїназної активності інактивували, заміню­ючи ESP на свіжоприготований ТЕ-буфер із 174 мкг/мл фенілметилсульфоніл-фториду (ФМСФ) фірми «Sigma Chemical Co», перемі­шували на шейкері при 18-22 °С. Буфер змі­нювали через дві години двічі. Далі блоки від­мивали від реагентів у 10 мл ТЕ-буфера, зміню­вали його тричі впродовж 6-18 год. Зберігали блоки в ТЕ-буфері при 4 °С.

Обробку рестриктазами проводили в про­бірках Еппендорф в об'ємі, вдвічі перевищую­чому об'єм агарозних блоків: 2 агарозних бло­ки — 100 мкл; десятикратний буфер для рес­трикції — 20 мкл; розчин альбуміну сироват­ки бика (20 мг/мл) — 1 мкл; бідистильована вода і ендонуклеаза (20 Од.акт.) — 79 мкл; за­гальний об'єм суміші — 200 мкл.

Ендонуклеазне переварювання хромосом­ної ДНК проводили при 37 °С впродовж однієї години. Повноту ферментативного розщеп­лення перевіряли методом пробного електро­форезу. На цей період пробірки із рестрикцій-ною сумішшю ставили на лід. Тривале збері­гання агарозних блоків із розщепленою ДНК проводили, як викладено вище.

Для електрофорезу використовували 1%-ву агарозу, виготовлену на 0,5 х трис-боратному буфері з бромістим етидієм (кінцева концентра­ція 0,5 мкг/мл). На доріжку завантажували 1/6-1/2 блока і заливали 0,5%-вою низько-плавкою агарозою. Умови електрофорезу: на­пруга поля 10 В/см, тривалість пульсу склада­ла 5 с у першу годину, далі — 30 с. Тривалість проведення електрофорезу 28-36 год. В якості реперних використовували стандартні оліго-нуклеотиди ендонуклеазного Hind III переварю­вання ДНК фага X [14]. Результати експеримен­ту візуалізували на трансілюмінаторі (хемоско-пі) в ультрафіолетових променях. Документу­вання результату в протоколі досліджень здійс­нювали у формі запису переліку розміру рес-трикційних фрагментів ДНК та у формі схем (комп'ютерних діаграм) електрофоретичних профілів, побудованих на основі їх фотографій (рисунок).

— —

0,1

 

 

 

 

 

 

 

 

0,6

_

_

_

_

_

_ _

_

_

_2,0

— —

2,3

 

-

 

 

 

 

 

 

= 4,4 _ 6,6

МІНІ

-

МІНІ

=

=

 

МІН

МІН

Z 9,4

 

 

 

 

 

 

 

 

_ 23

— лунки

1

Страницы:
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50 


Похожие статьи

Автор неизвестен - 13 самых важных уроков библии

Автор неизвестен - Беседы на книгу бытие

Автор неизвестен - Беседы на шестоднев

Автор неизвестен - Богословие

Автор неизвестен - Божественность христа