Автор неизвестен - Анатолій якович циганенкодо 75-річчя від дня народження - страница 20

Страницы:
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50 

2

3

4

5

6 7

8

9

10 в гелі т.н.п.

Схема ПЕФ-фрагментів Sma I-ендонуклеазної рестрикції ДНК хромосоми штамів S. аигеш: 1 — № 276; 2 — 291; 3 — 295; 4 — 543; 5 — 555; 6 — 579; 7 — 733; 8 — 743; 9 — 751; 10 — фраг­менти Hind III-ендонуклеазної рестрикції ДНК фага X

Результати та їх обговорення. Профілі електрофорезу (ПЕФ, фінгерпринти, патерни) фрагментів Sma I-ендонуклеазної рестрикції ДНК хромосоми досліджених 17 культур ста­філококів згрупували у 5 різних типів фінгер-принтів з 15-21 візуалізованими на треках фрагментами ДНК з розмірами від 320 до 0,1 тис. нуклеотидних пар (т.н.п.) (рисунок). При цьому 11 фрагментів (із розмірами від 200 до 0,1 т.н.п.) були ідентифіковані у треках усіх тестованих штамів, тому вони можуть бути ха­рактеристиками відповідного загальновидово-го або ще вищого таксономічного рангу. По­ліморфізм інших «необов'язкових» 4-10 фраг­ментів може використовуватись в якості гене­тичних ознак для внутрішньовидової (підви­дової) диференціації штамів S. aureus, ізольо­ваних в Лозівській районній лікарні.

Розпізнавальними особливостями фінгер-принтів групи культур із ЛОР-відділення від фінгерпринтів штамів іншого походження бу­ла наявність фрагментів з розмірами близько 250, 60, 40 і 14 т.н.п. та відсутність мінорного фрагмента розміром 9,3 т.н.п. Чітко виявлені відмінності у результатах АПДФР ХрДНК між культурами № 276, 295, з одного боку, і № 291 — з іншого. В останнього були відсутні фрагменти з розмірами близько 11; 8,5; 7,5 і 1,8 т.н.п., а візуалізувались оригінальні фраг­менти з розмірами близько 7 та 2,1 т.н.п.

Штами із пологового відділення теж ха­рактеризувались гетерогенністю профілів рестрикційних фрагментів на треках. ПЕФ більшої частини цих культур (№ 543, 548, 553, 555, 581) відрізнялись від усіх інших наявністю фрагментів розміром близько 320 т.н.п. Інші культури цього ж походжен­ня (№ 569, 579) мали відмінності ПЕФ у формі візуалізованих фрагментів з розмірами 11; 7,5та 7 т.н.п., відсутності мінорного фрагмента розміром 9,3 т.н.п. і фрагмента розміром близько 7 т.н.п.

Для всіх культур S. aureus, ізольованих у відділенні анестезії і реанімації, був характер­ний єдиний тип фінгерпринту. Від ПЕФ-шта-мів із ЛОР- і пологового відділення він відріз­нявся відсутністю мажорних фрагментів з роз­мірами близько 320 і 250 т.н.п. Крім того, ідентифікуюче значення мають фрагменти з розмірами близько 60, 40, 11, 9,3, 4,3 та 4,1 т.н.п. Саме присутність їх у поєднанні з інши­ми фрагментами в фінгерпринтах цих штамів робить їх генотипи оригінальними при порів­нянні з аналогічними характеристиками культур іншого походження.

Повторне проведення АПДФР ХрДНК піс­ля зберігання культур в лабораторних умовах впродовж трьох місяців виявило деяку зміну фінгерпринтів (відмінність полягала не в змі­ні кількості фрагментів на треках, а в зміні розміру «потужності» в останніх) у двох (11,8 %) культур (№ 581, 758). При цьому інші фрагменти електрофоретичного профілю зберігали своє попередньо визначене місце на треку. Це не дозволило констатувати спонтан­не виникнення нового (зміну попереднього) генотипу. Відтворюваність результатів, отри­маних методом АПДФР ХрДНК, залишається не досить з'ясованим питанням для фахівців [15, 16]. Теоретично очевидно, що навіть по­одинокі (спонтанні, або індуковані) мутації, зміна плазмідного профілю, а тим більш значні рекомбінації, які зачіпають сайти специфічної ендонуклеазної рестрикції, мо­жуть призвести до зміни фінгерпринтів. Од­нак, наскільки таке явище зможе вплинути на результати тестування всього пулу клітин бактерій без проведення попередньої селекції мутантів, залишається недослідженим.

Висновки

Результати внутрішньовидового типуван-ня методом АПДФР ХрДНК культур S. au-

Список літератури

1. Ахматов МА., Сидикова КА. Стафилококковые инфекции. (Микробиология, эпидемиология, специфическое лечение и профилактика). Ташкент: Медицина, 1982. 135 с.

2. Внутрибольничные инфекции. Пер. с анг. проф. Б.А. Годованого; Под ред. Р.П. Венцела. М.:

Медицина, 1990. 656 с.

3. Яфаев Р.Х., Зуева Л.П. Эпидемиология внутрибольничной инфекции. Л.: Медицина, 1989. 166 с.

4. Шагинян ИА Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анали­зе внутрибольничных инфекций. Клин. микробиол. и антимикробн. химиотерапия 2000; 2, 3: 82-95.

5. Шагинян ИА, Першина М.Ю. Генетические маркеры в эпидемиологии бактериальных инфек­ций. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997; 4: 54-59.

6. Demiani G., Telecco S., Comincini S. et al. Comparison of an improved RAPD fingerprinting with different typing methods for disсriminating clinical isolates of Staphylococcus spp. Eur. J. Epidemiol.

1996; 12, 2: 163-169.

7. Тимченко Е.Н., Волянский Ю.Л., Похил С.И. Анализ рестрикционного картирования ДНК как метод современного эпидемиологического типирования возбудителей инфекционных заболеваний. Вестн. проблем биол. и медицины 1997; 32: 78-86.

8. Похил С., Савин Р. Применение прибора «ПУЛЬС-ГЭФ для проведения гель-электрофореза в пульсирующем поле. Укр. журн. мед. техніки і технології 1997; 3-4: 71-75.

reus, ізольованих у період ускладнення епіде­мічної ситуації з захворюваності госпітальни­ми стафілококовими інфекціями в Лозівській районній лікарні в січні 1998 р., не дозволя­ють зробити висновок про формування і цир­куляцію єдиного (домінуючого) для цього лі­кувального закладу внутрішньогоспитально-го штаму. Виділені із різних профільних від­ділень (ЛОР-, пологового, анестезії і реаніма­ції) культури стафілококів представляють со­бою окремі (різні) клони, які «закріпились» в екобіологічних ареалах циркуляції, кордони яких фактично визначаються функціонально-територіальним принципом діяльності під­розділів лікувального закладу. Протиепіде­мічний бар'єрний режим у відділеннях (і між ними) не є абсолютним.

Обсяги (інтенсивність) змін ПДФР ХрДНК, на відміну від результатів фенотипування цієї ж групи штамів S. aureus, після зберігання культур в лабораторних умовах впродовж трьох місяців не дозволили констатувати спон­танне виникнення нового (зміну попереднього) фінгерпринту. Відтворюваність результатів, отриманих методом АПДФР ХрДНК, зали­шається актуальним питанням.

Використання методів внутрішньовидово­го типування мікроорганізмів на основі моле­кулярно-генетичних технологій дозволяє от­римати цінну інформацію для вирішення ши­рокого кола питань «молекулярної епідеміо­логії». На прикладі епідеміологічного, внут­рішньовидового типування госпітальних шта­мів стафілококів показана висока розрізняль­на ефективність (дискримінантність, чутли­вість, специфічність) АПДФР ХрДНК. По­дальше удосконалення цього методу полягає в комп'ютеризації процесу сканування гелів, програмного аналізу результатів і створенні національного банку даних фінгерпринтів для всіх мікроорганізмів з метою утворення елект­ронної мережі для їх швидкого порівняння і встановлення джерела інфекції.

9. Anand R. Pulsed field gel electrophoresis: a technique for fractionating large DNA molecules. Tre-nols Genet. 1986; 2, 11: 278-283.

10. Бантинг Г., Кантор Ч, Коллинз Ф. и др. Анализ генома. Методы. Пер. с англ. А.В. Рудина, Т.Л. Ивановой, С.А. Бушпры; Под ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 1990. 246 с.

11. Smith C.L., Cantor C.R. Purification, specific fragmentation, and separation of large DNA mole­cules. Methods Enzymol. 1987; 155: 449-467.

12. Weiss A.S. Analysis of large DNA fragments. Search. 1987; 28, 6: 302-303.

13. Goering R.V., Duensing T.D. Rapid fielt inversion gel electrophoresis in combination with an rRNA gene probe in the epidemiological evaluation of Staphylococci. J. Clin. Microbiol. 1990; 28, 3: 426-429.

14. Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С. и др. Методы молекулярной генетики и генной инжене­рии. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1990. 248 с.

15. Cookson B.D., Apiricio P., Deplano A. et al. Inter-centre comparison of pulsed-field gel electrophore-sis for the typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Med. Microbiol. 1996; 44: 179-184.

16. Branger C, Gardye C, Lambert-Zechovsky N. Persistence of Staphylococcus aureus strains among cystic fibrosis patients over extended periods of time. J. Med. Microbiol. 1996; 45: 294-301.

17. Тимченко О.М. Фено- та генотипування шпитальних штамів Staphylococcus aureus. Вісник Сум-

ДУ 2001; 32, 4: 143-147.

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBSP. AUREUS МЕТОДОМ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИНЫ ФРАГМЕНТОВ РЕСТРИКЦИИ ХРОМОСОМНОЙ ДНК (АПДФР ХРДНК) Е.Н. Тимченко

Проведено эпидемиологическое, внутривидовое типирование 17 штаммов Staphylococcus aureus subsp. aureus — возбудителей госпитальных инфекций методом анализа полиморфизма длины фраг­ментов рестрикции хромосомной ДНК. При осуществлении Sma I-эндонуклеазной рестрикции хро­мосомной ДНК стафилококков выявлено 5 типов фингерпринтов. Показано, что метод генотипиро-вания имеет ряд преимуществ перед традиционными методами фенотипирования и может быть ис­пользован в практике борьбы с инфекционными заболеваниями.

Ключевые слова: Staphylococcus aureus, метод генотипирования, рестрикция хромосомной ДНК, фингерпринты, паттерны.

USE OF ANALISIS OF CHROMOSOMAL DNA RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISMS (RFLPS) OF GENOTYPING HOSPITAL STRAINS STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBSP. AUREUS O.N. Timchenho

Epidemiological intraspecific typing of 17 strains of Staphylococcus aureus subsp. aureus — agents of infections diseases by analysis of chromosomal restriction fragment length polymorphisms. Staphylo-cocci give 5 types fingerprints with Sma I endonuclease-digestion chromosomal DNA. It was shown that this genotyping technique has a number of advantages compared to traditional phenotypic techniques and may be used in practice of fighting against infectious diseases.

Key words: Staphylococcus aureus subsp. aureus, genotyping, restriction of chromosomal DNA, fin­gerprints, patterns.

СПОСОБЫ ХРАНЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА,

СОДЕРЖАЩЕГО ВИРУС ГРИППА А.А. Цуцаева, А.Я. Цыганенко, И.А. Желтякова, Н.В. Павленко

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Харьковский государственный медицинский университет

Выполнено сравнительное изучение эффективности использования низких температур для хранения патологического материала, обеспечивающих надежное сохранение исход­ных свойств вируса гриппа. Установлено, что криоконсервирование является надежным способом хранения патологического материала без изменения свойств возбудителя неог­раниченный промежуток времени. В секционном материале достоверно увеличивается количество свободного вируса, который определяется в реакции гемагглютинации. Ключевые слова: криоконсервирование, патологический материал, вирус гриппа, титр вируса.

Разработка надежных способов долгосроч­ного хранения возбудителей различных забо­леваний в составе патологического материа­ла является актуальной проблемой. Эта про­блема обостряется в эпидпериоды, когда не­обходимо не только выделить возбудители, но и правильно их идентифицировать, опреде­лить родовую, видовую и типовую принадлеж­ность, штаммоспецифичность, чувствитель­ность к антибиотикам и другим лекарствен­ным веществам. Проведение качественной и комплексной диагностики заболеваний воз­можно только в условиях специализирован­ных, оснащенных необходимым оборудовани­ем и реактивами лабораториях.

Сказанное в первую очередь относится к заболеваниям вирусной этиологии, таким как СПИД, вирусные гепатиты, респираторные и гриппозные инфекции.

Материалом для исследований при вирус­ных заболеваниях является кровь, спинно­мозговая жидкость, соскобы и смывы со сли­зистой оболочки носоглотки, секционный ма­териал. В этих биологических объектах виру­сы инактивируются быстрее всего, что делает материал непригодным для использования с диагностической целью [1].

Известным способом сохранения патологи­ческого вируссодержащего материала является его погружение в стерильный 40-80%-ный рас­твор глицерина или раствор Хенкса с добавле­нием антибиотиков и хранение при температу­ре +4 °С [2]. Недостатками этого способа явля­ются ограничение сроков хранения (до 7 дней); наличие определенных сред и то, что при хра­нении патологического материала, содержаще­го вирус гриппа при гипотермии, титр вируса достоверно падает уже через 24 ч хранения.

Другим, применяемым на данный момент способом является помещение патологическо­го вируссодержащего материала в морозиль­ную камеру бытового холодильника и хране­ние его при температуре -20 °C. Секционный материал предварительно помещается в сте­рильные флаконы, содержащие 5,0 см3 фос­фатно-буферного раствора (рН 7,2-7,4) с до­бавлением антибиотиков [2]. Недостатками этого способа является ограничение сроков хранения (до 3 недель) и то, что при хранении патологического вируссодержащего материа­ла при умеренно низких температурах титр вируса достоверно падает на 5-11-е сутки.

Целью данной работы явилась разработка методов долгосрочного хранения патологиче­ского и секционного материала, полученного от экспериментальных животных, заражен­ных вирусом гриппа, штамм А/Victoria.

Материал и методы. Опыты проводились на мышах-самцах линии Balb/C, массой 18­20 г, которые заражались вирусом гриппа, штамм А/Victoria, в дозе LD 100/10.

Животные были разбиты на две группы. Животным 1-й (контрольной) группы в коли­честве 80 особей был введен физиологический раствор; 2-й (опытной) группы (10 особей) — вирус гриппа. Материал вводился интрана-зально по 0,025 мл в каждую ноздрю.

На 3-и сутки инфекционного процесса жи­вотные умерщвлялись с помощью эфира и по­следующей декапитацией.

Объектом исследований служили смыв из носоглотки и секционный материал (слизи­стая носоглотки, трахея и легкие). Наличие вируса и его титр определяли с помощью ре­акций гемагглютинации и гемадсорбции. Из трахеи, легких и слизистой носоглотки гото­вили гистологические препараты, которые ок­рашивали гематоксилин-эозином.

Смыв из носоглотки осуществляли физио­логическим раствором в объеме 1 мл на однуносоглотку. Ткань легких, трахеи, слизистой носоглотки измельчали ножницами и расти­рали в ступке со стерильным песком. Из рас­тертого материала готовили суспензию клеток на физиологическом растворе и центрифуги­ровали 20 мин при 33 с-1. Вирус определяли в надосадочной жидкости [3].

В реакции гемагглютинации использовали 1%-ную взвесь эритроцитов человека группы 0 (1). Эритроциты предварительно трехкратно отмывали в физиологическом растворе.

Постановка реакции гемагглютинации (РГА): в лунках планшета готовили последо­вательные двукратные разведения исследуе­мого материала. В опыт включали и две кон­трольные лунки с физиологическим раство­ром. После добавления эритроцитов смесь в лунках перемешивали и инкубировали 45 мин

при 37 °С [3].

Постановка реакции гемадсорбции (РГ) проводилась по общепринятой методике [3] в модификации.

Исследуемый материал, растертый в ступ­ке, переносили в пробирку, добавляли 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов человека. Пробир­ки инкубировали при температуре +4 °С в те­чение 30 мин, встряхивали, добавляли 2 мл фи­зиологического раствора, вновь встряхивали, надосадочную жидкость отбирали пипеткой, а из осадка готовили мазок-отпечаток, который окрашивали по Романовскому-Гимзе.

Часть выделенного материала оставили на хранение в условиях гипотермии (+4, 0, -20 °С), другую часть криоконсервировали пу­тем быстрого погружения в жидкий азот и хранили при -196 °С.

Материал отогревали при температуре 40­41 °С.

Результаты. Вирусная инфекция у мышей сопровождалась развитием ринита, который проявлялся обильными, серозно-слизистыми выделениями из носа.

При гистологическом исследовании в сли­зистой носоглотки определялась выраженная сосудистая реакция, мононуклеарная инфильт­рация подслизистого слоя и десквамация эпи­телия. В легких наблюдались некроз ткани, мо-нонуклеарная инфильтрация в межальвеоляр­ное простанство, кровоизлияния. В ряде аль­веол наблюдалась десквамация эпителиальных клеток. В просвете сосудов, наряду с эритроци­тами, определялись мононуклеарные клетки и нейтрофилы. В бронхиолах обнаруживались отек и десквамация эпителия, выход эритроци­тов и ядерных клеток крови в просвет эпителия. Все эти данные подтверждают развитие грип­позной инфекции (рис. 1).

При исследовании нативного патологиче­ского материала на наличие вируса гриппа A было установлено, что титр вируса в смыве из

Рис. 1. Срез ткани легких, пораженных вирусом гриппа, x100:

1 десквамация эпителия бронха; 2 — разрыв альвеол; 3 кровоизлияния; 4 — бронх, заполненный кровью

носоглотки и ткани легких составлял 1:32. Количество пораженных вирусом клеток в ткани легких — 25 %.

Титр вируса в смыве из носоглотки досто­верно снижался в 4 раза уже через 24 ч хране­ния при +4 и 0 °С; при -20 °С титр вируса дос­товерно падал в 16 раз на 3-и сутки хранения. На 11-е сутки вирус уже не определялся в ма­териале, хранившемся при названной темпе­ратуре.

Криоконсервирование, независимо от ре­жимов охлаждения, и хранение смыва из но­соглотки при -196 °С не вызывало изменений титра вируса на протяжении срока наблюде­ния (1 год), рис. 2.

Разведение

І5 4

1:32. 1:16. 1:8 .

1:4

1:2 1:1

О       1       3       5       6      10      11     365 Сутки

Рис. 2. Динамика изменения титра вируса в смыве из носоглотки в зависимости от температуры и сроков хранения: 1 — +4 C; 2 — 0; 3 — -20; 4 — -196; 5 нативн. материал

В ткани легких, хранившихся при +4 и 0 °С, титр вируса достоверно не изменялся в те­чение 8 суток, а затем резко падал, и на 16-е сутки вирус в материале уже не определялся.

Хранение материала при -20 °С не вызы­вало достоверных изменений титра вируса в течение 16 суток. Затем титр достоверно па­дал, и к 24-м суткам вирус в материале не оп­ределялся.

При криоконсервировании ткани легких путем быстрого погружения в жидкий азот титр вируса резко возрастал в 4 раза и досто­верно не изменялся на протяжении одного го­да хранения (рис. 3).

Разведение

4

Страницы:
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50 


Похожие статьи

Автор неизвестен - 13 самых важных уроков библии

Автор неизвестен - Беседы на книгу бытие

Автор неизвестен - Беседы на шестоднев

Автор неизвестен - Богословие

Автор неизвестен - Божественность христа