Л В Кузнецова - Клінічна та лабораторна імунологія - страница 13

Страницы:
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  51  52  53  54  55  56  57  58  59  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  71  72  73  74  75  76  77  78  79  80  81  82  83  84  85  86  87  88  89  90  91  92  93  94  95  96  97  98  99  100  101  102  103  104  105  106  107  108  109  110  111  112  113  114  115  116  117  118  119  120  121  122  123  124  125  126  127  128  129  130  131 

Зменшення загальної кількості комплементу відбувається при: СЧВ з ураженням нирок, гострому гломерулонефриті, сироватковій хворо­бі, імунокомплексних захворюваннях, цирозі печінки, комбінованих імунодефіцитах, септичному ендокардиті з гломерулонефритом, реци-дивуючих ангіоневротичних набряках, пароксизмальній холодовій ге­моглобінурії, міастенії Гравіс, вірусному гепатиті з ураженням суглобів, змішаній кріоглобулінемії, лімфомі.

Крім загальної гемолітичної активності комплементу, за допомо­гою радіальної імунодифузії по Манчіні визначають концентрацію окремих компонентів комплементу (частіше С3 та С4 ). Визначення C3 і C4 дозволяє встановити переважаючий шлях активації комплементу. C4 витрачається лише при активації за класичним шляхом. C3 бере участь як у класичному, так і в альтернативному шляху активації, проте при активації за альтернативним шляхом рівень C3 знижується значніше.

Кріоглобуліни — це імуноглобуліни сироватки, які оборотно пре-ципітують при температурі нижче 37C. Для виявлення кріоглобулінів збирають кров, дають їй згорнутися і відбирають сироватку. Всі маніпу­ляції проводять при кімнатній температурі. Сироватку на ніч поміща­ють у холодильник (при 4°C), після чого центрифугують і визначають, яку частину її об'єму займає преципітат. Точніший спосіб заснований на визначенні спектрофотометрії білка у відмитому преципітаті, отри­маному з фіксованого об'єму сироватки.

Преципітат, що містить як моноклональні (наприклад, ревматоїд­ний чинник), так і поліклональні (наприклад, IgG) антитіла, назива­ється змішаними кріоглобулінами. Змішана кріоглобулінемія зазвичай виявляється при васкулітах шкіри. При цьому найчастіше вражаються ділянки тіла, схильні до дії холоду. Змішана кріоглобулінемія харак­терна для автоімунних захворювань. Вона спостерігається при СЧВ, вузликовому періартеріїті, синдромі Шегрена і хворобі Кавасакі. Гепа­тити A, B і C завжди супроводяться кріоглобулінемією. Кріоглобуліни виявляються також при гемобластозах, хронічних інфекціях і сарко-їдозі. Якщо кріопреципітати містять лише моноклональні антитіла, виключають мієломну хворобу і макроглобулінемію Вальденстрема.

Визначення показників фагоцитозу:

Фагоцитарна активність нейтрофілів звичайно підвищується на початку розвитку запального процесу. Її зниження призводить до хронізації запального процесу та підтримання автоімунного процесу,тому що при цьому порушується функція руйнування та виведення циркулюючих імунних комплексів із організму.

Фагоцитарне число: середня кількість мікроорганізмів, погли­нутих одним нейтрофілом крові. Характеризує поглинальну здатність нейтрофілів. В нормі складає 5 - 10 мікробних частин.*

Процент фагоцитозу - процент нейтрофілів, що беруть участь в фагоцитозі. В нормі складає 65 - 95%.

Підвищення показників спостерігається при: антигенному подраз­ненні внаслідок бактеріального запалення (продромальний період, пе­ріод гострого прояву інфекції) при нормальній активності фагоцитозу; лейкоцитозі; алергічних реакціях; автоімунних захворюваннях; по­силенні антитілозалежної цитотоксичності та реакції на донорський трансплантат.

Зниження показників спостерігається при: хронічних запальних захворюваннях бактеріальної та вірусної природи; вроджених дефектах фагоцитарної системи, синдромі Чедіака - Хігасі, хворобі Дауна, СЧВ, коллагенозах, хворобі імунних комплексів, дефіциті імуноглобулінів, комплементу; лікуванні цитостатиками, імунодепресантами, опромі­ненням іонізуючою радіацією; вторинних та первинних імунодефіцитах; новоутвореннях; тяжких опіках, травмах, стресах; кишкових та нирко­вих синдромах втраті білку; недостатності харчування; недостатності фагоцитозу; хронізації запального процесу.

Спонтанний тест з НСТ (нітросиній тетразолій) дозволяє оціни­ти ступінь антигенного подразнення не активованих in vitro грануло­цитів крові. Він характеризує ступінь активації внутрішньоклітинних антибактеріальних систем. Принцип методу ґрунтується на віднов­ленні поглинутого фагоцитом розчинного барвника нітросинього те-тразолію в нерозчинний діформазан під впливом супероксиданіону, що утворюється в НАДФ-Н-оксидазній реакції, яка ініціює процес стимуляції фагоциту. До фагоцитів додають жовтий фарбник нітро-синій тетразолій, в нормі при його поглинанні метаболічна активність фагоцитів зростає, нітросиній тетразолій відновлюється, продукти цієї реакції забарвлені в синій колір. Про порушення метаболізму фагоцитів судять по зниженню інтенсивності синього фарбування. При виявленні порушень визначають рівень цитохрому Ь558 та інших білків фагоцитів. Показники НСТ-тесту підвищуються в початково­му періоді гострих бактеріальних інфекцій, тоді як при хронічному перебігу інфекційного процесу вони знижуються. Санація організму від збудників супроводжується нормалізацією показника. Різке зни­ження свідчить про декомпенсацію протиінфекційного захисту та є прогностично несприятливою ознакою.

Показник спонтанного НСТ-тесту в нормі складає до 10 %.

Підвищення показників спостерігається при: антигенному подраз­ненні внаслідок бактеріального запалення (продромальний період, пе­ріод гострого прояву інфекції) при нормальній активності фагоцитозу; хронічному гранулематозі; лейкоцитозі; алергічних реакціях; автоімун­них захворюваннях; посиленні антитілозалежної цитотоксичності.

Зниження показників спостерігається при: хронічних запальних захворюваннях бактеріальної та вірусної природи; вроджених дефектах фагоцитарної системи, синдромі Чедіака - Хігасі, хворобі Дауна, СЧВ, коллагенозах, хворобах імунних комплексів, дефіциті імуноглобулінів, комплементу; лікуванні цитостатиками, імунодепресантами, опромі­ненням іонізуючою радіацією; вторинних та первинних імунодефіци­тах новоутвореннях, тяжких опіках, травмах, стресах; недостатності фагоцитозу; хронізації запального процесу.

Індукований НСТ—тест дозволяє оцінити функціональний резерв кисеньзалежного механізму бактерицидності фагоцитів. Тест викорис­товують для виявлення резервних можливостей внутрішньоклітинних систем фагоцитів. При збереженій внутрішньоклітинній антибакте­ріальній активності у фагоцитах різко зростає кількість формазан-позитивних нейтрофілів після їх стимуляції латексом. Зниження по­казників стимульованого НСТ-тесту нейтрофілів нижче за 20% та моноцитів нижче за 30% свідчать про недостатність фагоцитозу. Вели­чина стимульованого НСТ-тесту в нормі складає 20 - 40%.

Оцінка фагоцитарної активності лейкоцитів — найбільш ін­формативний спосіб дослідження опсонінів і функціонального стану фагоцитів.

Техніка проведення:

1. Лейкоцити, виділені з крові хворого, відмивають від сироват­ки, підраховують і поміщають в середовище, що містить сироватку здорового або хворого (джерело опсонінів) і живі бактерії (зазвичай Staphylococcus aureus або Escherichia coli).

2. Суміш інкубують при 37°C, відбираючи проби через 0, 30, 60 і 120 хв після початку інкубації. Для визначення числа життєздатних бактерій кожну пробу швидко охолоджують і роблять посів.

3. Через 2 год після початку інкубації суміш центрифугують. Лей­коцити і фагоцитовані бактерії осідають на дно, а нефагоцитовані бак­терії залишаються в надосадовій рідині. У осіданні і надосадовій рідині визначають число життєздатних бактерій.

Оцінка результатів. У нормі протягом 2 год фагоцитами поглинаєть­ся і руйнується близько 95% бактерій. При хронічній гранулематозній хворобі число зруйнованих бактерій не перевищує 10%, а усерединілейкоцитів виявляються життєздатні бактерії. Присутність живих бак­терій в лейкоцитах при інкубації з сироваткою здорового свідчить про порушення переварювання бактерій у відсутність зниження здібності до захоплення бактерій. Підвищений вміст життєздатних бактерій в надосадовій рідині при інкубації з сироваткою хворого свідчить про дефіцит опсонінів.

Хемотаксис лейкоцитів. Порушення хемотаксису може бути обу­мовлене дефектом фагоцитів, наявністю інгібіторів хемотаксису, дефі­цитом сироваткових або тканинних чинників хемотаксису.

Метод шкірного вікна. За допомогою скальпеля видаляють поверх­невий шар епідермісу площею 4 мм2 (при цьому повинна з'явитися не­велика кількість крові). На пошкоджену ділянку поміщають покривне скло. Протягом доби кожні 0,5—2 год покривне скло міняють. Потім стекла забарвлюють і досліджують під мікроскопом лейкоцити, що знаходяться на них. У нормі протягом перших 2 год спостерігається притік нейтрофілів до місця пошкодження. Протягом подальших 12 год нейтрофіли заміщаються моноцитами.

Дослідження хемотаксису in vitro. Засноване на стимуляції виді­лених з крові фагоцитів чинниками хемотаксису. Здібність фагоцитів до направленої міграції можна оцінити, помістивши їх в камеру Бойдена або чашку Петрі з агарозою.

Адгезія лейкоцитів. Порушення адгезії лейкоцитів обумовлене зниженням експресії або відсутністю на їх поверхні молекул адгезії, наприклад CD11/CD18. Для визначення молекул адгезії застосовують проточну цитофлюоріметрію. Відсутність CD11/CD18 на нейтрофілах і моноцитах виявляється пізнім відпаданням пуповини, рецидивуючими бактерійними інфекціями, пародонтитом. Адгезію лейкоцитів можна також оцінити по їх здатності прилипати до ендотеліальних клітин.

Імунологічні тести, які характеризують клітинний імунітет

(Т — ланка)

Т-клітинний імунітет оцінюють за такими показниками:

• Кількість Т-лімфоцитів;

• Визначення субпопуляцій Т-лімфоцитів

Проточна цитометрія проводиться з використанням монокло-нальних антитіл, пов'язаних з флюоресцентними фарбниками про­водять прикрасу клітинних елементів крові. Моноклональні антитіла мають ідентичну специфічність до мембранних антигенів, тому вони згруповані і позначені відповідним номером кластера диференціюван­ня (CD). Клітини крові поодинці перетинають сфокусований світловийщіпок, зазвичай лазерний. Світло певної довжини порушує молекули флуоресціюючих фарбників, пов'язаних з різними клітинними компо­нентами, при цьому може відбуватися одночасне збудження декількох різних фарбників, що дозволяє оцінити відразу декілька клітинних па­раметрів. Світло, що випускається фарбниками, збирають за допомогою системи лінз і дзеркал і розкладають на компоненти. Світлові сигнали детектують, перетворять в електричні імпульси і далі у форму, зручну для комп'ютерної обробки і зберігання інформації.

Всі Т-лімфоцити мають поверхневий рецептор (кластер диференці­ювання. CD2, зрілі лімфоцити - CD3, Т- хелпери CD4, Т- супресори / цитотоксичні Т-лімфоцити - CD-8, NK-клітини - CD-16.

Метод розеткоутворення. Тест розеткоутворення з еритроцитами барана (Е-РУК, розеткоутворюючі клітини. Застосовують для виявлення Т-лімфоцитів. Показано, що Е-рецептори ідентичні CD2, що виявляєть­ся моноклональними антитілами і присутні на Т-клітинах).

Е-РУК тот. - загальна кількість Т-лімфоцитів, що утворили ро­зетки.

Е-РУК акт. - кількість Т-лімфоцитів, що утворили активні розет­ки. Активні розетки утворюються при чітко певному співвідношенні кількостей еритроцитів і лімфоцитів, яке у декілька разів нижче, ніж достатньо для насичення реакції, і без інкубації після центрифу­гування.

Е - РУК + ГТ - кількість Т-лімфоцитів, що утворили гравітаційні розетки. Гравітаційні розетки утворюються при спонтанній седимента­ції клітин, тобто без центрифугування, протягом 1 год).

Тести навантажень з лікарськими і другими речовинами. За­звичай застосовують інкубацію клітин протягом певного часу з неве­ликими дозами, близькими до фізіологічних кількостей препаратів або без них. Тести ставлять з лікарськими препаратами, зокрема імуноко-ригуючими (тималін, левомізол і ін.) для того, щоб, визначивши дію препарату на клітини, прогнозувати ефективність його застосування при лікуванні.

У розеткоутворенні найчастіше використовуються наступні тести навантаження:

1. інкубація клітин при 37°С протягом 0,5-2 год;

2. інкубація клітин протягом того ж часу з розчинами різних пре­паратів в концентраціях, близьких до фізіологічних, наприклад з ле-вамізалом, теофіліном, Т-активіном, іншими імунокоригуючими пре­паратами;

3. інкубація клітин з різними дозами цих же препаратів.

Тест навантаження Е-розеткоутворення з теофіліном є спо­собом оцінки функціональних субпопуляцій лімфоцитів, оскільки ін­кубація з цим препаратом приводить до зменшення розеткоутворення переважно клітин, що мають суп ресорну активність, мало впливаючи на клітини з хелперною активністю. Теофілін-резістентні Т-клітини - субпопуляція Т-лімфоцитів, що мають хелперну (CD4. Активність, теофілін-чутливі Т-клітини - субпопуляція Т-лімфоцитів, що мають супресорну (CD8. Активність.

Нульові клітини (%) визначають по формулі 100 (%) - (Е-РУК +

М-РУК).

Реакція бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ. Длястиму-ляції Т-лімфоцитів in vitro використовують наступні речовини.

1) Мітогени фітогемаглютинін, конканавалін A та ін. — виклика­ють неспецифічну (не обумовлену пов'язанням з антигенрозпізнаючими рецепторами) активацію Т-лімфоцитів.

2) Розчинні антигени антигени Candida albicans, правцевий анаток­син — зв'язуючись з антигенрозпізнаючими рецепторами Т-лімфоцитів пам'яті, викликають специфічну активацію цих клітин.

3) Алогенні клітини (у змішаній культурі лімфоцитів) активують Т-лімфоцити, оскільки несуть на своїй поверхні антигени HLA класу II.

4) Антитіла до поверхневих антигенів Т-лімфоцитів, що беруть участь в їх активації, — CD2, CD3, CD43.

5) Хімічні речовини, наприклад форболмірістатацетат (активує протеїнкіназу C) і іономіцин (підвищує зміст внутрішньоклітинного кальцію).

Активацію Т-лімфоцитів зазвичай оцінюють за наступними показ­никами.

1. Проліферація.

2. Вироблення цитокінів — интерлейкінів-2 -4, -5, інтерферона у, чинника некрозу пухлин.

3. Експресія маркерів активації — CD25 і антигенів HLA класу II.

4. Цитотоксичність.

Під дією мітогенів, антигенів і алогенних кліток Т-лімфоцити, що покояться, активуються, перетворюються на бластні клітини і почи­нають ділитися.

Спонтанна проліферація лімфоцитів (бласттрансформація) буває підвищена у хворих, що перенесли багатократні переливання крові, хворих алергічними і автоімунними захворюваннями, при бактерійних і вірусних інфекціях, а також у новонароджених.

Оцінку клітинного імунітету проводять також за допомогою шкірних проб, заснованих на алергічних реакціях сповільненого типу.

Антигени для проведення проб підбирають на підставі даних анамнезу. Позитивна реакція при проведенні шкірних проб дозволяє виключити важку недостатність клітинного імунітету, тоді як негативна реакція не має діагностичного значення. Дози антигенів для проведення шкірних проб приведені у табл. 4.

Таблиця 4.

Схема проведення шкірних проб при оцінці клітинного імунітету

Антиген(а)

Розведення(б)

Еритема і ущільнення, мм

Розведення

Еритема і ущільнення, мм

 

 

24 год

48 год

 

24 год

48 год

Дерматофітін 0

1:100

 

 

1:10

 

 

Правцевий анатоксин

1:100

 

 

1:10

 

 

Антиген вірусу епідемічного паротиту(в)

Нерозведений

 

 

 

 

 

Тріхофітон

1:30

 

 

 

 

 

Туберкулін

5 ед

 

 

250 Од

 

 

(а) Дерматофітін 0 (антиген Candida albicans. можна придбати в Майлс Еллерджі Продактс правцевий анатоксин у Уайет-Ейрест Леборетріс, антиген вірусу епідемічного паротиту для шкірних проб (ефективні дози цього антигена не встановлені) в Коннот Леборетріс, тріхофітон (антиген Trychophyton spp.) в Майлс Еллерджі Продактс. Для оцінки результатів шкірних проб в динаміці необхідно: 1) обкреслити краї набряку і еритеми чорнильною ручкою; 2) по­містити прозору стрічку на обкреслену ділянку і злегка притиснути до нього, щоб чорнило віддрукувалося на стрічці; 3) зберігати стрічку разом з протоколом оцінки результатів шкір­них проб. (б) При підозрі на сенсибілізацію до антигена збільшують розведення, наприклад до 1:500 або 1:1000. (в) Цей антиген не вводять хворим з алергією до яєць і тиомерсалу.

При проведенні цього дослідження необхідно дотримувати наступні правила.

1. Слід упевнитися в активності антигена, для чого шкірну пробу потрібно спочатку провести у здорової людини, чутливої до нього.

2. Слід враховувати, що при проведенні проб на фоні імуносупре-сивної терапії можливі псевдонегативні результати.

3. Слід з'ясувати, чи контактував хворий у минулому з антигена­ми, використовуваними при постановці проб, і якщо так, чи не було при цьому місцевих або системних реакцій. При важких реакціях в анамнезі шкірні проби з даним антигеном не проводять або проводять з менш концентрованим антигеном.

4. Шкірні проби проводять таким чином.

— Для шкірної ін'єкції використовують окремий стерильний тубер­куліновий шприц об'ємом 1 мл і голку 27 G завдовжки 13 мм.

— У шприц набирають 0,1 мл розчину антигена, видаляють буль­башки повітря.

Страницы:
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  51  52  53  54  55  56  57  58  59  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  71  72  73  74  75  76  77  78  79  80  81  82  83  84  85  86  87  88  89  90  91  92  93  94  95  96  97  98  99  100  101  102  103  104  105  106  107  108  109  110  111  112  113  114  115  116  117  118  119  120  121  122  123  124  125  126  127  128  129  130  131 


Похожие статьи

Л В Кузнецова - Клінічна та лабораторна імунологія