Л В Кузнецова - Клінічна та лабораторна імунологія - страница 14

Страницы:
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  51  52  53  54  55  56  57  58  59  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  71  72  73  74  75  76  77  78  79  80  81  82  83  84  85  86  87  88  89  90  91  92  93  94  95  96  97  98  99  100  101  102  103  104  105  106  107  108  109  110  111  112  113  114  115  116  117  118  119  120  121  122  123  124  125  126  127  128  129  130  131 

— Антиген вводять внутрішньошкірно в передпліччя або спину.

— Відразу після введення антигену в місці ін'єкції повинен з'явитися пухир діаметром 5—10 мм. Якщо пухир не з'явився, ін'єкція зроблена не внутрішньошкірно, а підшкірно. В цьому випадку антиген вводять повторно в іншу ділянку шкіри.

— Місце ін'єкції обводять, наприклад кульковою ручкою.

— Результати оцінюють через 24 і 48 год. Якщо через 24 год резуль­тат проби негативний, можна вводити більш концентрований розчин антигену.

— Для проведення шкірних проб зазвичай використовується ко­мерційний набір Мультітест CMI, що складається з 7 антигенів: Candida albicans, Trichophyton spp., Proteus spp., правцевого анатоксину, правцевого анатоксину, стрептокінази і очищеного туберкуліну. Слід зазначити, що оцінка результатів досліджен­ня із застосуванням цього набору часто буває утруднена, оскіль­ки при позитивній реакції пухир може бути невеликим (трохи більше 2 мм).

Імунологічні тести, які характеризують гуморальний імунітет

(В — ланка)

Гуморальну ланку імунної системи оцінюють за такими показни­ками:

• Кількість В-лімфоцитів;

• Кількість сироваткових імуноглобулінів (класів A, M,G, E).

В теперішній час з метою ідентифікації лімфоцитів використовують 3 групи методів: імунофлюорисценція - проточна цитометрія, розетко-утоворення, імуноферментний аналіз.

Метод проточної цитометрїі. На клітинній мембрані лімфоцитів зна­ходиться безліч глікопротеїдів, які можна виявити при проточній цитофлю-ориметрії за допомогою моноклональних антитіл. Деякі з цих глікопротеїдів специфічні для певного типу клітин, наприклад T-, B- і NK-лімфоцитів, різних субпопуляцій T-лімфоцитів, моноцитів, і навіть для певних стадій їх дозрівання і диференціювання. Ці молекули прийнято позначати CD. Визна­чення В-лімфоцитів за допомогою проточної цитофлюориметрії засноване на виявленні імуноглобулінів, фіксованих на поверхні клітин, CD19 і CD20. При оцінці результатів дослідження необхідно враховувати вік хворого. У дітей старшого віку і дорослих В-лімфоцити складають 10—20% всіх лім­фоцитів крові, у дітей молодшого віку їх більше.

Метод розеткоутворення ґрунтується на наявності на мембрані В-лімфоциту рецептора для Fc-фрагменту імуноглобулінів та третього компоненту системи комплементу (С3). Вони здатні утворювати розетки лише з еритроцитами миші, які оброблені антитілами, та в присутностікомплементу (ЕМ-РУК). Показано, що ЕМ-рецептори ідентичні тим, що виявляються моноклональними антитілами CD22, і присутні на зрілих B-лімфоцитах. Таким чином, тест розеткоутворення з еритро­цитами миші (ЕМ-РУК) використовують для виявлення В-лімфоцитів, що мають рецептори CD22.

Визначення абсолютної кількості В-лімфоцитів. Абсолютна кіль­кість В-лімфоцитів в нормі складає 0,28 - 0,31 *106 /л).

Підвищення абсолютної кількості В-лімфоцитів спостерігається при: гострих бактеріальних, грибкових, паразитарних захворюваннях, СНІД (початковий період), хронічних захворювання печінки (цироз, вірусний гепатит), автоімунних захворюваннях (ревматоїдний артрит, СЧВ, ревматизм, коллагенози), саркоїдозі, муковісцидозі, хворобі Кро­на, хворобі Вальденстрема, моноклональній гаммапатії, інфекційному мононуклеозі, хронічному лімфолейкозі, в гострому періоді повторної інфекції.

Зниження абсолютної кількості В-лімфоцитів спостерігається при: фізіологічній гіпогамаглобулінемії у дітей (у віці 3 - 5 міс), вродженій гіпогамаглобулінемії або агамаглобулінемії, новоутвореннях імунної системи, лікуванні цитостатиками і імунодепресантами, станах після видалення селезінки, недостатності гуморальної ланки імунітету.

Визначення IgG, IgA, IgM методом радіальної імунодифузії по

Mancini et al, оснований на тому, що зразки досліджуваних сироваток поміщують у лунки агару, який містить антитіла до Ig одного з класів IgG, IgA, у відомій концентрації. Імуноглобуліни, дифундуючи з лунок в агар, при взаємодії з відповідними антитілами будуть утворю­вати кільця преципітації, розмір яких знаходиться в тісній залежності від вмісту в сироватці обстежуваного Ig того чи іншого класу. Рівень сироваткових Ig відображує функціональний стан В-клітинної ланки імунної системи у відповідь на стимуляцію організму антигенними по­дразниками.

Підвищення концентрації IgA спостерігається при: гострій та хро­нічній бактеріальній, грибковій, паразитарній інфекції, хронічних за­хворюваннях печінки, цирозі, ревматоїдному артриті, СЧВ, хронічному лімфолейкозі, мієломній хворобі, моноклональній гаммапатії, хворобі Вальденстрема, ендотеліомі, остеосаркомі, кандидозі, муковісцидозі, захворюваннях дихальних шляхів.

Зменшення концентрації IgA спостерігається при: фізіологічній гіпогамаглобулінемії у дітей (у віці 3 -5 міс), вродженій гіпогамагло-булінемії або агамаглобулінемії, новоутвореннях імунної системи, лі­куванні цитостатиками і імунодепресантами, станах після видаленняселезінки, кишкових та ниркових синдромах втрати білку, гострих вірусних, хронічних бактеріальних інфекціях.

Підвищення концентрації IgM спостерігається при: гострих та хро­нічних бактеріальних, грибкових, паразитарних інфекціях, гострих вірусних гепатитах, цирозі, ревматоїдному артриті, СЧВ, гострому та хронічному лімфолейкозі, мієломній хворобі, макроглобулінемії Вальденстрема, ендотеліомі, остеосаркомі, кандидозі, муковісцидозі, захворюваннях дихальних шляхів.

Зменшення концентрації IgM спостерігається при: фізіологічній гіпогамаглобулінемії у дітей віці 3-5 міс), вродженій гіпогамагло-булінемії або агамаглобулінемії, новоутвореннях імунної системи, лі­куванні цитостатиками і імунодепресантами, опроміненні іонізуючою радіацією, станах після видалення селезінки, кишкових та ниркових синдромах втрати білку, хронічній вірусній інфекції, недостатності гуморальної ланки імунітету.

Підвищення концентрації IgG спостерігається при: гострих та хро­нічних бактеріальних, грибкових, паразитарних інфекціях, гострих та хронічних захворювання печінки, цирозі, вірусному гепатиті, авто­імунних захворюваннях, ревматоїдному артриті, СЧВ, саркоїдозі, муко-вісцидозі, хронічному лімфолейкозі, мієломній хворобі, інфекційному мононуклеозі, моноклональній гаммапатії, хворобі Вальденстрема, ре­конвалесценції первинної бактеріальної інфекції, при гострому періоді повторної інфекції, СНІД.

Зменшення концентрації IgG спостерігається при: фізіологічній гіпогамаглобулінемії у дітей віці 3 -5 міс), вродженій гіпогамаглобу-лінемії або агамаглобулінемії, новоутворенні імунної системи, лікуванні цитостатиками і імунодепресантами, станах після видалення селезінки, кишкових та ниркових синдромах втрати білку, при хронічній вірусній інфекції, гемоглобінопатії.

Імуноглобулін Е (ІgЕ) - клас імуноглобулінів, виявлений в нормі в незначній кількості в сироватці крові та секретах слизових оболонок та ендокринних залоз. Основна біологічна роль IgE пов'язана із його здатністю зв'язуватися із поверхнею опасистих клітин та базофілів людини. Тільки ці клітини несуть високоафінний глікопротеїновий рецептор до IgE.

IgE приймає участь в алергічний реакціях І (негайного) типу, а також приймає участь у захисному протигельмінтному імунітеті, що обумовлено існуванням перехресного зв'язування між IgE та антигеном гельмінтів.

Визначення IgE імуноферментним методом (ELISA-тест).

Алерген, наприклад екстракт пилку, імобілізують на сорбенті, якийпотім інкубують із сироваткою хворого. Кількість зв'язанного із сор­бентом специфічного IgE визначають за допомогою антитіл до IgE, що імобілізовані у лунках на спеціальних планшетах.

В нормі IgE складає менше 0,001% від всього імуноглобуліну сиро­ватки крові. Вміст IgE в сироватці крові здорових людей залежно від віку представлений в таблиці 5:

Таблиця 5.

Значення нормальних рівнів концентрації імуноглобуліну E в сироватці крові залежно від віку

Вікові групи

Вміст IgE (кОд/л)

Новонароджені

0 - 2

Діти:

 

3 - 6 міс

3 - 10

1 рік

8 - 20

5 років

10 - 50

10 років

15 - 60

Дорослі

20 - 100

IgE можна виявити в організмі людини вже на ІІ-му тижні внутріш-ньоутробного розвитку. Вміст IgE в сироватці крові зростає поступово із моменту народження людини до підліткового віку. У похилому віці рівень IgE може знижуватися.

Методи для виявлення антитіл та антигенів

1. Методи, основані на реакції преципітації - утворення осаду з нерозчинних комплексів антиген-антитіло в розчині, агарі, гелі (не­фелометрія; проста, подвійна і радіальна імунодифузія; імуноелек-троферез; непряма преципітація). Таким чином у клінічній імунології визначаються рівні імуноглобулінів за методом Манчіні, походження крові чи сперми у судовій медицині, кількісні і якісні властивості білків у біохімічних препаратах. В організмі за допомогою преципітації ней­тралізуються віруси і бактерійні (наприклад, дифтерійний. токсини. В імунопатології за рахунок преципітації реалізується феномен Артюса (один з проявів гіперчутливості), коли преципітат блокує мікроцирку-ляцію і тим спричиняє локальний некроз.

2. Методи, основані на реакції аглютинації (пряма та непряма аглютинація - осадження клітин, навантажених антигенами (еритро­цитів, лейкоцитів, тромбоцитів, сперматозоїдів при діагностиці без­пліддя), імуноглобулінами-аглютинінами. Застосовується у діагностиці тифу і туберкульозу, імунологічного безпліддя, визначенні груп крові (ABO);

3. Методи, основані на реакції лізису бувають двох видів: а) реакція зв'язування комплементу (грунтується на використовуванні комплемен­ту у двох конкуруючих парних системах антиген-антитіло); б) реакція комплементарної фіксації (грунтується на використовуванні компле­менту у двох послідовно реагуючих парних системах антиген-антитіло). Таким чином встановлюють рівень антитіл до вірусів поліомієліту, віспи, епідемічного паротиту, герпесу, грипу чи бактерій гонореї, ту­беркульозу, сифілісу (реакція Васермана);

4. Методи, основані на використанні мічених антитіл та анти­генів підрозділяються на:

а. імунофлюоресцентний метод (імунне фарбування) - визна­чення антигенів (пряма реакція) чи антитіл (непряма) шляхом детекції флюоресцуючих (мічених) комплексів. Таким чином визначаються популяції і субпопуляції імуноцитів (метод моноклональних антитіл), антигени, антитіла і потенційні алергени в сироватці і тканинах (іму-ногістохімічне дослідження);

б. імуноферментний метод - визначення антигенів (пряма реак­ція) чи антитіл (непряма) шляхом їх взаємодії відповідно з антитілом чи антигеном, міченими ферментами. За допомогою цього методу можна якісно і кількісно визначати антигени і антитіла, інтерлейкіни, інтер­ферони, імуноглобуліни, потенційні алергени. Модифікаціями цього методу є:

ELISA-тест на ВІЛ - утворення пошарового «сендвіча» антитіло-антиген-антитіло;

— вестерн-блот - проведення імуноферментного аналізу після попе­реднього розділення антигенів у гелі електроферезом і перене­сенні (блотингу) їх на нерухомий папір.

Лабораторна діагностика алергічних захворювань in vitro

Специфічні методи алергодіагностики направлені на:

виявлення вільних антитіл в сироватці крові і секретах;

— виявлення антитіл, пов'язаних з лейкоцитами (базофілами, ней­трофілами, тромбоцитами та ін.);

— визначення Т-лімфоцитів, сенсибілізованих до алергену.

ВИЗНАЧЕННЯ РІВНЯ АЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧНИХ IgE

Імуноферментний аналіз (ІФА) включає використання анти­тіл, що мітяться ферментом. Суть ІФА полягає в тому, що при дода­ванні досліджуваної сироватки, що містить IgE-антитіла до алергену, зв'язаного з поверхнею полістиролу у мікропланшеті, утворюєтьсякомплекс алерген-антитіло IgE. Кількість IgE, що зв'язався, тобто ан­титіл, визначають за допомогою мічених ферментом антитіл проти IgE. Для цього в лунки планшету для аналізу вносять анти-IgE-антитіла, що мітяться пероксидазою хріну (або іншим ферментом) і сироватку хворого. В результаті цього антитіла проти IgE специфічно зв'язуються з IgE, що знаходиться в комплексі алерген-антитіло IgE або вільними від антигена (алергену). Надалі додають реагенти (орто-фенілендиамід і перекис водню) і виявляють активність пероксидази по кольоровій реакції, інтенсивність якої оцінюють на спектрофотометрі.

Метод ІФА виявляє тільки «надлишок» IgE, вільних антитіл в си­роватці крові, але не визначає антитіла, що зв'язалися з мембранами кліток - базофілами та іншими лейкоцитами. Тому негативний тест не гарантує відсутність у хворого «озброєних» базофілів IgE і розвиток алер­гічної реакції. Позитивний тест на специфічні IgE указує на алергію.

Нефелометричний метод мікропреципітації по Уан'є застосо­вують для виявлення IgG-, IgM-антитіл до гаптену (лікам) в сироватці крові. Готують двократні розведення алергену і сироватки крові хворого. До однієї кювети фотоелектроколориметра (ФЕК) вносять 1,5-1,8 мл досліджуваної сироватки крові (початкове розведення 1:2), в іншу -контрольний розчин або сироватку крові здорової людини. Вимірюють початкову оптичну щільність на спектрофотометрі (світлофільтр №4, при довжині хвилі = 500 нм). Потім в кожну кювету додають по 0,1 мл розведеного алергену, починаючи з мінімальної концентрації, і пере­мішують. Через 2 хвил знову визначають оптичну щільність суміші в кюветах. Реакцію проводять спочатку з різними розведеннями алерге­ну, потім, коли визначена його мінімальна концентрація - з сироват­кою (для визначення її титру). Оптимальна концентрація гаптену - це та, яка викликає затримку зниження або навіть збільшення оптичної щільності суміші. Реакція обумовлена утворенням імунних комплексів антиген+антитіло в розчині. При випробуванні ліків орієнтовною кон­центрацією є добова доза, розчинена в 1 л дистильованої води.

Реакція вважається позитивною, якщо оптична щільність суміші сироватка + алерген при додаванні певних його концентрацій (як при негативному результаті) не знижується або навіть збільшується.

Непрямий метод викиду іонів калію з лейкоцитів використовуєть­ся для виявлення антитіл в сироватці крові. Лейкоцити здорової людини обробляють сироваткою хворого з алергією, і якщо в ній були антитіла, то вони зв'язуються з лейкоцитами. Доданий алерген зв'язувався з анти­тілами і викликав викид калію в реакційне середовище. Концентрацію іонів калію визначають на полум'яному фотометрі.

Порівнюють концентрацію іонів калію в контрольних і опитних пробах. Перевищення калію в опиті менше ніж на 15% в порівнянні з контролем — реакція негативна. Збільшення концентрації калію в опиті більш ніж на 20% в порівнянні з контролем указує на сенсибілізацію до лікарського препарату, від 15 до 20% — реакція сумнівна.

Реакція пошкодження нейтрофілів грунтується на пошкодженні лейкоцитів під впливом алергену. За допомогою цієї реакції можливо оцінити гіперчутливість негайного типу. Найбільш доцільно застосу­вання цієї методики для виявлення сенсибілізації до медикаментів. Позитивною реакція (наявність гіперчутливості) вважається тоді, коли кількість лейкоцитів зменшилась на 20-30 %.

Реакції, засновані на виділенні сенсибілізованими лейкоцитами медіаторів, ферментів та інших біологічно активних речовин під впливом алергенів.

Визначення рівня сульфідо-лейкотрієнів (CAST ELISA). Після ін­кубації лейкоцитів з алергеном визначати приріст в надосадовій рідині рівня сульфідо-лейкотрієнів (ЛТС4).

Визначення антитіл, пов'язаних з лейкоцитами

Прямий тест дегрануляції базофілів (ТДБ) заснований на дегра-нуляції базофілів хворих алергією, сенсибілізованих антитілами класу IgE під впливом специфічного алергену. Натще у хворого отримують 10-15 мл (1 мл - 1 алерген) крові з вени в пробірку з гепарином (20 Од/ мл). У лунки планшету для імунологічних досліджень вносять по 0,05 мл суспензії лейкоцитів, в опитні лунки - рівний об'єм алергенів, в конт­рольних - розчинник. Інкубують 15 хвил при 37°С і додають в кожну лунку по 0,05 мл розчину толуїдинового синього. Суспензією заповню­ють камеру Горяєва і підраховують кількість забарвлених базофілів. У контролі повинно міститися не менше 30 клітин. Реакція вважається позитивною, якщо число забарвлених клітин в опиті зменшувалося на

Страницы:
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  51  52  53  54  55  56  57  58  59  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  71  72  73  74  75  76  77  78  79  80  81  82  83  84  85  86  87  88  89  90  91  92  93  94  95  96  97  98  99  100  101  102  103  104  105  106  107  108  109  110  111  112  113  114  115  116  117  118  119  120  121  122  123  124  125  126  127  128  129  130  131 


Похожие статьи

Л В Кузнецова - Клінічна та лабораторна імунологія