Л В Кузнецова - Клінічна та лабораторна імунологія - страница 59

j = J e-kdC

1 =J°Є (1)

де І0 - інтенсивність падаючого світла, І - інтенсивність світла після проходження поглинаючого шару, k - молярний коефіцієнт поглинання світла; d - товщина поглинаючого шару, С - концен­трація атомів в поглинаючому шарі. Абсорбційний коефіцієнт k залежить від властивостей погли­наючого шару і довжини світлової хвилі, але не залежить від атомної концентрації.

Кількісний аналіз речовини по спектрах поглинання ґрунтується на існуванні певної функціональної залежності між концентрацією елемента в поглинаючому шарі й одним з параметрів, що характеризує процес поглинання. При практичних вимірах звичайно користуються значеннями оптичної густини поглинання D (адсорбційною здатністю), що є експериментальною мірою концентрації елемента:

D = fe IjSL = k ■ d ■ C

1 (2)

Як слідує з виразу (2) залежність між абсорбційною здатністю D і концентрацією C має лінійний характер і не залежить від температури атомізатора.

Як і у випадку атомно-емісійної спектрометрії для виконання атомно-абсорбційного аналізу необхідно випарувати аналізовану біо-пробу й нагріти утворений при цьому газ до температури, при якій від­бувається повна або хоча б часткова дисоціація молекул. Суть аналізу полягає в тому, щоб освітити монохромним світлом атомізовану пробу, потім розкласти пройшовший через пробу світловий потік світловим диспергатором і на виході зафіксувати поглинання детектором (рис.4).

При наявності відповідного джерела світла, тип і концентрація мікро­елементу визначають по виміряному абсорбційному спектру [6]. Атомно-абсорбційні спектрометри дозволяють аналізувати до 70 елементів у пробі із чутливістю в інтервалі 10-4 - 10-9 % мас., що важливо для оцінки взаємодії між різними мікроелементами.

Рис. 4. Метод атомно-адсорбційної спектроскопії.

Атомно-адсорбційний спектрометр містить наступні функціональні блоки: первинне світлове джерело, атомізатор, монохроматор, детектор, блок управління (рис.4). Спектрофотометри забезпечуються набором приставок для одержання спектрів відбиття, роботи зі зразками при низьких і високих температурах, для аналізу характеристик джерел і приймачів випромінювання і т.п.

В якості зовнішнього джерела світла для збудження атомів вико­ристовуються лампа з порожнистим катодом, безелектродна лампа, лазер. Джерело світла випромінює з енергією, необхідної для збудження енергетичних рівнів відповідного типу атомів. Вимоги вузькосмуговості обмежують можливу кількість збуджуваних електронних рівнів, що обумовлює необхідність використання окремих джерел світла на кожен аналізований елемент для розширення діапазону і забезпечення високої вибірковості методу.

В сучасній техніці атомно-адсорбційної спектроскопії викорис­товуються два основних способи атомізації: полуменева та електро­термічна. В атомізаторі для перетворення речовини проби в атомну пару температура повинна досягати 2000-3000 °С, швидкість набору температури - 4000-8000 °С/с. При полуменевій атомізації джерелом теплової енергії є суміш горючих газів з окислювачами (ацетилен/пові­тря - полум'я з Т~2300°С, ацетилен/закис азоту - полум'я з Т~3200°С). Соплом пальника встановлюють вздовж оптичної вісі для збільшення товщини поглинаючого шару. При електротермічному способі атомі-зації, як правило, проба розміщується в виготовленій з електропровід­ного матеріалу кюветі. При пропусканні струму розігрівається кюветаі проба, що знаходиться всередині. Перевага даного методу в тому, що речовина проби залишається в замкнутому об'ємі трубчастої камери і на відміну від полуменевих атомізаторів не переноситься газовим по­током. Матеріал камери повинен витримувати високі температури, не реагувати з атомними парами й мати високу корозійну стійкість (як правило, це графіт). Для виключення дифузії газу через стінки і збільшення довговічності графіт покривають шаром газонепроникного піровуглецю. Температура графітової камери регулюється спеціальним електронним пристроєм з програмним керуванням. Межа виявлення більшості елементів при атомізації в полум'ї має значення 1-100 мкг/л, у графітовій камері в 100-1000 разів нижче.

Монохроматор виділяє довжину хвилі, на якій здійснюється вимі­рювання оптичного сигналу. Для розкладання світла використовують диспергаторні елементи (дифракційні ґратки, призми, світлофільтри). Детектор забезпечує точний вимір рівня світлової енергії, Детектори звичайно класифікують на підставі їх селективності на універсальні, селективні для певної групи речовин, специфічні для одного або обмеже­ного кола компонентів з подібними хімічними характеристиками. Блок управління забезпечує автоматизоване керування спектрофотометром, відображення і обробку одержуваних експериментальних результатів. Програмне забезпечення сучасних спектроаналізаторів дозволяє автома­тично розраховувати концентрацію окремих елементів по інтенсивності їхніх спектральних ліній з корекцією фону і спектральних перекриттів, здійснювати статистичну обробку вимірів.

Перевагами методу атомно-абсорбційної спектроскопії є його висока чутливість та висока селективність. Метод відзначається простотою і не­значним впливом складу проби на результати аналізу. Обмеження цього виду аналізу пов'язані з неможливістю одночасного визначення кількох елементів при використанні лінійчатих джерел випромінювання й, як правило, необхідність переведення проб у розчин. Недоліками є необ­хідність використання горючих газів (при пломеневій атомізації).

Основні труднощі при використанні даного методу для досліджень в біології та медицині виникають у зв'язку з наявністю в об'єкті матри­ці, яка може суттєво впливати на процеси абсорбції. Так, стандартні методи аналізу мінеральних компонентів крові - атомно-абсорбційний та атомно-емісійний хіміко-спектральний аналіз - вимагають попере­дньої мінералізації зразка і нейтралізації матричних впливів, тобто видалення білків та іншої органіки. Для цього зразок спочатку вису­шують, а потім спалюють (білки згоряють, а метали залишаються) або руйнують органічні речовини при взаємодії з кислотою. У результаті на один аналіз витрачається від двох-трьох годин до одного дня. Крімтого, ці методи вимагають дорогого й складного устаткування, доступ­ного тільки великим науково-дослідним центрам.

Приблизна схема аналітичного процесу при атомно-абсорбційному методі може бути наступною:

• Пробопідготовка;

• Створення поглинаючого газоподібного шару в атомізаторі;

• Пропускання зовнішнього світлового потоку через поглинаючий шар;

• Розклад в спектр поглинання (з виділенням відповідних харак­теристичних частот);

• Кількісна оцінка величини поглинання (за допомогою градую-вальних характеристик);

• Обчислення концентрації досліджуваного елемента.

Методи флуоресцентної спектроскопії

Атомно-флуоресцентна спектроскопія. Для визначення кількос­ті мікроелементів можуть бути застосовуватися не лише спектральні дослідження емісії або поглинання світла, але також дослідження флу­оресценції - спектрофлуорометричні методи. Одним з варіантів емісій­ної спектроскопії, що поєднує принципи обох розглянутих вище методів атомно-емісійного і атомно-абсорбційного аналізу, є атомно-флуоресцентна спектроскопія. Метод базується на дослідженні характеристичних спектрів флуоресценції атомами елементів аналізованої проби.

Аналітичним сигналом, як і у випадку атомно-емісійної спектроско­пії, є інтенсивність випромінювання збудженими атомами в ультрафіо­летовій або видимій області спектра. Однак механізми випромінювання в атомно-емісійній й атомно-флуоресцентній спектроскопії різні. У першому випадку атоми випромінюють, будучи збудженими під дією теплової енергії. В атомно-флуоресцентній спектроскопії збудження нейтральних атомів аналізованого елемента в газовій фазі відбувається в атомізаторі під впливом зовнішнього джерела випромінювання. Кож­ному збудженому стану атома відповідає своя індивідуальна енергія і відповідно довжина хвилі збуджуючого фотона. У випадку неспівпадін-ня між енергією міжрівневого переходу і енергією зовнішнього джерела збудження атома не відбувається. Необхідною умовою для виникнення атомно-флуоресцентного випромінювання є попереднє поглинання ато­мами кванта світла відповідної ї енергії, тому будучи по суті емісійним, метод має багато спільного з атомно-абсорбційною спектроскопією. Як і в методі атомної абсорбції при переході збуджених атомів в основний стан вимірюється виділена частка енергії, але не по величині поглинан­ня, а по інтенсивності флуоресцетного випромінювання.

Головна перевага методу атомно-флуоресцентної спектроскопії -його висока селективність (найвища серед методів оптичної атомної спектроскопії), обумовлена винятковою простотою спектрів атомної флуоресценції, що призводить до відсутності накладення спектральних ліній різних елементів. До недоліків методу атомно-флуоресцентної спектрометрії варто віднести проблемність одночасного визначення декількох елементів.

Приблизна схема аналітичного процесу при атомно-флуоресцентному методі може бути наступною:

• Пробопідготовка;

• Дисоціація (атомізація молекул проби);

• Збудження атомів проби від зовнішнього джерела світла;

• Реєстрація спектра флуоресцентного випромінювання;

• Визначення кількісного вмісту елементів (з використанням гра-дуювальних залежностей)

Рентгено-флуоресцентна спектроскопія. Рентгено-флуорес-центний аналіз - один із сучасних спектроскопічних методів дослі­дження елементного складу речовини. Метод базується на аналізі спектра, отриманого при дії на досліджуваний матеріал рентгенів­ським випромінюванням. Рентгенівське випромінювання - це елек­тромагнітне випромінювання з довжиною хвилі в діапазоні від 0.01 до 100 нм. В рентгено-флуоресцентному аналізі використовується випромінювання з довжинами хвиль від 0,04 до 1,8 нм, що являє со­бою потік високоенеретичних фотонів. При опроміненні первинним рентгенівським випромінюванням атом переходить у збуджений стан, що супроводжується переходом електронів на більш високі квантові рівні. При цьому електрони із зовнішніх оболонок можуть заповнюва­ти вакантні місця і випромінювати надлишок енергії у вигляді фото­на або передавати надлишок енергії іншому електрону із зовнішніх оболонок (Оже-електрону).

Обов'язковими елементами рентгено-флуоресцентних спектрометрів є джерело збудження вторинного флуоресцентного характеристичного рентгенівського випромінювання і аналізатор цього випромінювання. Джерелом збуджуючого первинного випромінювання звичайно служить рентгенівська трубка, у якій в умовах вакууму спіраль катода емітує електрони, що прискорюються прикладеним електричним полем і бом­бардують атоми анодного матеріалу. Для дослідження легких елементів цілком достатньо встановити напруга 10 кв, для середніх 20-30 кв, для важких - 40-50 кв. Метод універсальний і дозволяє визначати більше 80 елементів в одній пробі в широкому діапазоні атомних номерів від

Mg (Z=12) до Pu (Z=94) і їхніх кількостей (від 100 до 10-4 мас. %, а в окремих випадках і менше.

Після попадання на детектор фотоелектрони перетворюються в ім­пульси напруги, інформація про які після підрахунку передається на комп'ютер. Сучасні рентгено-флуоресцентні спектрометри обов'язково забезпечуються програмним забезпеченням для визначення кількісного елементного складу проби. По піках отриманого спектра можна якісно визначити, які елементи присутні в зразку. Для одержання точного кількісного вмісту необхідно обробити отриманий спектр за допомогою програми калібрування (кількісного градуювання приладу). При кіль­кісному аналізі спектр невідомої речовини порівнюється зі спектрами отриманими при опроміненні стандартних зразків і в такий спосіб отримується інформація про кількісний елементний склад і будову речовини.

Із серії методів рентгенівської спектроскопії (рентгено-емісійний, рентгено-абсорбційний і рентген-флуоресцентний) останній має найбіль­шу чутливість і дозволяє виготовляти на його основі порівняно дешеві портативні прилади. Перевагами рентгено-флуоресцентного аналізу є висока акспресність вимірів (кілька хвилин), він є не руйнуючим ме­тодом контролю. Метод відзначається простотою пробопідготовки, не потребує атомізації біопроби, робить непотрібними операції вимірів кількості проби - зважування, визначення об'єму та ін. Аналізовані зразки можуть бути як рідкими так і твердими, причому останні можуть мати будь-яку консистенцію.

Завдяки простоті, економічності, можливості експрес-аналізу, точності, відсутності складної пробопідготовки, сфери застосування рентгено-флуоресцентного методу продовжують розширюватися. Зо­крема, вказані переваги роблять його досить перспективним при визна­ченні мікроелементів не тільки біосубстратів організму (волосся, крові, сечі та ін.), але й при аналізі різних біологічних і медичних об'єктів (питної води, соків, алкогольних напоїв, медпрепаратів, лікувальних харчових добавок і т.д.).

Приблизна схема аналітичного процесу при рентгено-флуорес-центному методі може бути наступною:

• Пробопідготовка;

• Опромінення проби первинним рентгенівським потоком;

• Реєстрація спектра вторинного флуоресцентного рентгенівсько­го випромінювання

Мас-спектрометричний аналіз

Мас-спектрометричний аналіз - метод дослідження речовини шля­хом визначення відношення маси до заряду і кількості заряджених час­ток, що утворюються при тому чи іншому процесі впливу на речовину (іонізації). Істотна відмінність мас-спектрометрії від інших аналітичних фізико-хімічних методів полягає в тому, що в оптични, рентгенівських методах детектують випромінювання або поглинання енергії атомами, а в мас-спектрометрії фіксуються безпосередньо самі іонізовані частки речовини. Атоми хімічних елементів характеризуються специфічною масою і її точне визначення дозволяє встановити елементний склад проби.

Мас-спектр - залежність інтенсивності іонного струму від відношен­ня маси до заряду. Через квантування маси й заряду типовий мас-спектр є дискретним. Першою необхідною умовою отримання мас-спектру є перетворення нейтральних молекул та атомів в заряджені частки - іони. Другою умовою є доставка іонів в газовій фазі в вакуумну частину мас-спектрометра, де забезпечується їх безперешкодний рух. В твердо фаз­них зразках для аналізу елементного складу застосовуються жорсткі ме­тоди іонізації, що необхідно для розриву атомних зв'язків зі значними енергіями (іонізація в індуктивно-зв'язаній плазмі, термоіонізація або поверхнева іонізація, іонізація в тліючому розряді та іскровій іонізації, іонізація в процесі лазерної абляції). Природа аналізованої речовини, особливості методу іонізації й вторинних процесів (метастабільні іони, не пружне розсіювання) можуть залишати свій слід у мас-спектрі.

I :

Плазма

Рис. 5. Метод мас-спектрометрії.з іонізацією в плазмі

Найважливішими технічними характеристиками мас-спектрометрів є чутливість, динамічний діапазон, роздільна здатність, швидкість сканування. Одним з найбільш інформативних методів аналізу мікро елементного складу біопроб є метод мас-спектрометрії в індуктивно-зв язаній плазмі, який дозволяє одночасно здійснювати багатоелемент­ний кількісний аналіз на рівні слідів елементів (рис.5). Індуктивно-зв язана плазма - це розряд в плазмі, що збуджується в потоці аргону і підтримується дією високочастотного електромагнітного поля. Темпе­ратура плазми може досягати 10 000°С, що забезпечує повну атомізацію елементів проби й мінімізує ефекти хімічної взаємодії. В індуктивно-зв'язаній плазмі отримуються однозарядні іони з матриць елементів у пробі, які потім направляються в мас-спектрометр і розділяються по співвідношенню маси до заряду. Іони з певним відношенням маси до заряду надходять до детектора, що визначає їх тип і кількість.

Програмне забезпечення сучасних аналізаторів здатне з високою точністю й продуктивністю автоматично розраховувати концентрацію досліджуваних елементів по інтенсивності їхніх спектральних ліній. Будучи об'єднаним із хроматографічними методами розділу метод мас-спектрометрії дозволяє визначати точні форми знаходження елементів у зразку, а не тільки їхні загальні концентрації. Істотним недоліком ме­тоду є дорожнеча, що обмежує його використання в умовах клініки.

ДЖЕРЕЛА УЧБОВОЇ ІНФОРМАЦІЇ

1. Клінічна імунологія та алергологія: Підручник / [Г.М. Дранік, О.С. Прилуцький, Ю.І. Бажора та ін.]; за ред. проф. Г.М. Драніка.-К.: Здоров'я, 2006.- 888 с.

2. Клиническая иммунология и аллергология: Учебное пособие / под ред. А.В. Караулова.- М.: Медицинское информационное агентство, 2002.- 651 с.

3. Плейфейер Дж.Х.Л. Наглядная иммунология : пер.с англ./ Дж. Х.Л. Плейфейер, Б. М. Чейн. -2-е изд., перераб. и доп.. -М.: ГЭОТАР-Медиа,

2008. -120 с.:

4. Никулин БА. Оценка и коррекция иммунного статуса / Никулин Б.А.-М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.- 376 с.

5. КудринА.В. Микроэлементы в иммунологии и онкологии. / А. В. Ку­дрин, О. А. Громова. -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. -544 с.

6. Спектральный анализ чистых веществ Беков Г.И., Бойцов А.А., Боль-шов М.А. и др / Под ред. Х.И. Зильберштейна. СПб.: Химия, 1994.

- 336 с.

7. Основы аналитической химии. Кн. 2. Методы химического анализа: Учеб. для вузов / [Золотов Ю.А., Дорохова Е.Н, Фадеева В.И. и др.]. -М.: Высшая школа, 2000. -450 с.

ТЕМА 8.

ПРИРОДЖЕНІ ІМУНОДЕФІЦИТНІ ЗАХВОРЮВАННЯ

Актуальність теми: Стійкість до інфекцій обумовлена захисними механізмами організму. Перша лінія захисту представлена механічни­ми бар'єрами шкіри і слизових оболонок. Бар'єрну функцію слизових оболонок доповнює функціонування миготливого епітелію, захисні властивості слизу, лізоциму, лактоферіну та інтерферонів. У видаленні мікробів, що проникли через шкіру і слизові оболонки, беруть участь комплемент, нейтрофіли і макрофаги, які є другою лінією захисту ор­ганізму від чужорідного. Проте, головну роль у стійкості до інфекції беруть участь антитіла, T і В-лімфоцити. Тому природжені дефекти структури і функції лімфоцитів найбільш часто приводять до виник­нення первинних імунодефіцитів.

Хоча первинні імунодефіцити зустрічаються рідко але виявлення їх повинно проводитися інтенсивно, тому що такі діти можуть бути осередками розповсюдження найрізноманітніших збудників на фоні пригнічення функції імунної системи.

Загальна мета: Вивчити механізми розвитку, клінічні ознаки, осо­бливості імунодіагностики, підходи до лікування природжених Т - і В - залежних імунодефіцитних захворювань, обумовлених порушенням фагоцитарної ланки імунітету і дефіцитом білків комплементу.

Конкретні цілі:

1. Визначитися у специфіці проявів первинних імунодефіцитів.

2. Скласти програму обстеження хворого.

3. Знайомство з класифікацією первинних імунодефіцитів.

4. Визначити тяжкість клінічних проявів і навчитися диференцію­вати симптоматику того або іншого первинного імунодефіциту.

5. Встановити діагноз і визначити його ускладнення.

6. Характеристика основних видів первинних імунодефіцитів.

7. Визначити тактику лікування і профілактики захворювання з урахуванням клінічних проявів і особливостей перебігу.

Початковий рівень знань — умінь:

1. Збір скарг, анамнезу, проведення об'єктивного обстеження паці­єнтів з природженими та набутими імуно-дефіцитними станами.

2. Інтерпретація результатів лабораторних досліджень (гемограми та імунограми).

3. Виявлення в анамнезі, об'єктивних даних та в імунограмі ознак, що вказують на можливість наявності первинного іму­нодефіциту.

4. Уявлення про методи лікування первинних імунодефіцитів

5. Розуміння динаміки основних показників лейкограми і імуно-грами при первинних імунодефіцитах.

6. Демонструвати володіння морально-деонтологічними принципа­ми медичного фахівця і принципами професійної субординації.

ЗАВДАННЯ ДЛЯ ПЕРЕВІРКИ ПОЧАТКОВОГО РІВНЯ ЗНАНЬ

1. Вкажіть основні типи недостатності природженого імунітету:

A. Дефекти фагоцитуючих клітин

B. Недостатність системи комплементу

C. Т-клітинний дефіцит

D. В-клітинний дефіцит

E. Недостатність стволових клітин

F. Жоден з перерахованих типів імунодефіцитів не може бути природженим

2. Які захворювання можуть бути обумовлені зниженням ефектив­ності фагоцитозу?

A. Хвороба Чедіака-Хігасі

B. Гнійникові інфекції

C. Системні кандидози

D. Жодне з перерахованих захворювань

Похожие статьи

Л В Кузнецова - Клінічна та лабораторна імунологія