церебралу - Вивчення хімічного складу і біологічної активності препарату групи трофінотропінів - страница 1

Страницы:
1 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF L'VIV UNIV.

Серія біологічна. 2005. Вип. 40. С. 10-15 Biology series. 2005. Is. 40. P. 10-15

УДК 542.95

ВИВЧЕННЯ ХІМІЧНОГО СКЛАДУ І БІОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРЕПАРАТУ ГРУПИ ТРОФІНОТРОПІНІВ - ЦЕРЕБРАЛУ

О. Макаренко*, Н. Карандєєва**, І. Васильєва*

*Інститут нейрохірургії ім.А.П.Ромоданоеа АМН України, вул. Мануільського, 8, м. Київ 03022, Україна e-mail: ira@neuro.ua **ЗАТ"Дніпрофарм" пр. КарлаМаркса,12, м. Дніпропетровськ, Україна e-mail: dp@dneprofarm.ua

Досліджено хімічний склад церебралу - першого представника ряду трофінотропних препаратів мозку. З'ясовано, що препарат є складною ком­позицією вільних амінокислот, низькомолекулярних пептидів і білків. Голо­вними компонентами є пептиди з молекулярними масами 680-1350 Да. В пептидній фракції церебралу переважають глутамінова, аспарагінова аміно­кислоти, аланін, гліцин, серин. Передбачають, що високоефективна антиін-сультна дія зумовлена наявністю в препараті специфічного комплексу тро-фінотропних регуляторних пептидів з невеликою молекулярною масою.

Ключові слова: нейротрофіни, пептиди низькомолекулярні, протиінсультний препарат.

Дослідницькі праці останніх десятиліть у галузі хімії, біології пептидів та їхнього фармакологічного використання свідчать про наявність значної кількості біологічно ак­тивних чинників білкової природи і низькомолекулярних пептидів, які виконують низку функцій у живому організмі: регулюють фагоцитоз, контролюють окисно-відновні про­цеси, активність гормонів і ферментів [5,13]; керують процесами макромолекулярного синтезу [11]; виявляють нейромодулювальну дію, стимулюють і пролонгують виживання клітин різних органів і тканин [9].

Пошук пептидів, що виявляють очікуваний селективний фармакологічний ефект, звичайно ведуть у кількох напрямах. Передусім це виділення індивідуальних пептидів і пептидних гормонів із природного матеріалу і визначення структурно-функційної організа­ції таких молекул, що передбачає виділення «загальних» фрагментів, «активних центрів», «якірних» ділянок амінокислотного ланцюга; іншим аспектом пошуку є синтез невеликих специфічних амінокислотних комбінацій (звичайно три-дев'ять залишків) і перевірка їх­ньої специфічної активності. Трудомісткість і тривалість таких досліджень очевидні.

Однак більшості проблем такого екстенсивного вибору можна уникнути, викорис­товуючи властивість організму відповідати на надходження збудників захворювань чи травматичний вплив виробленням захисних чинників білково-пептидної природи і дослі­джуючи речовини, що виникають і накопичуються в клітинах тканин, включених у про­цес посттравматичної автотерапії.

Сьогодні безсумнівно, що одним зі шляхів підвищення ефективності терапії бага­тьох захворювань центральної нервової системи (ЦНС) (хвороби Альцгеймера, деменції, пов'язаної з ВІЛ, травматичного враження мозку та інших захворювань) є введення в комплексні схеми лікування різних модифікаторів біохімічних реакцій, що мають пепти-дну природу (цитокінів, хемокінів тощо) [6-8, 12]. Модифікатори відіграють важливу роль у механізмі виживання нейронів у разі ішемії, травми, розвитку нейродегенератив-

© Макаренко О., Карандєєва Н., Васильєва І., 2005них захворювань і клітинної смерті [8,10]. Групу ендогенно-терапевтичних чинників, які назвали трофінотропінами чи нейротрофінотропними регуляторними чинниками, активно виробляють клітини мозку в постінсультному (посттравматичному) періоді.

Ми наведемо результати вивчення хімічного складу і біологічної активності пер­шого препарату з групи трофінотропінів - церебралу. Розроблений авторами [2] новий нейротропний протиінсультний препарат одержують з мозку свиней з експерименталь­но відтвореним бінапівкульовим геморагічним інсультом (ГІ). Після виділення й оброб­ки активної речовини отриманий препарат (церебрал) є пептидним трофінотропним регуляторним чинником щодо цитокінів мозку, що утворюються в ушкоджених ткани­нах мозку. Цей чинник прискорює процес відновлення і функції альтерованих нейронів, виявляє тригерну, нейроцитопротекторну, трофінотропну та антиоксидантну дію.

У праці досліджено механізм регулювання синтезу і секреції ростових чинників у ЦНС тварин з гострою цереброваскулярною патологією. Перевірено гіпотезу про те, що, крім регулювального впливу, трофінотропін церебралу має нейроактивувальний вплив на синтез і секрецію ростового чинника нервової тканини (ФРН) у тварин з експе­риментальним автогеморагічним інсультом.

Церебрал запропонований для лікування найгострішого і гострого періодів роз­витку ГІ та фаз декомпенсації, у перспективі його використовуватимуть для лікування неврологічних захворювань і станів, що супроводжуються надходженням крові в мозок чи у ліквор, органічних захворювань головного мозку (дитячий церебральний параліч, розсіяний склероз, СДАТ і ін.).

Для якісного дослідження складу церебралу використовували загальноприйняті реакції: на пептидний зв' язок - біуретову реакцію, на ДНК - реакцію з дифеніламіном, орцинову реакцію - на РНК [4]. Залишковий вміст білка визначали методом Бредфорда (мікроваріант) [3]. Вміст азоту визначали після мінералізації зразка за методом К'єльда-ля, фосфору - після спалювання наважки зразка в кисні за фарбуванням відновленого фосфорно-молібденового комплексу.

Компоненти препарату церебрал і контрольного препарату фракціювали методом гель-фільтрації на колонці (1,5*50,0 см), заповненій сефадексом G-15 (фірми "Pharmacia", Швеція): 2 мл розчину препарату в 0,1 М натрій-фосфатному буфері з рН 8,0 наносили на колонку, попередньо врівноважену тим же буфером, і елюювали зі швидкістю 15 мл/год. Фракціювання виконували при температурі +4°С. Кількісний вміст компонентів фракцій визначали денситометрично. Оптичну густину фракцій вимі­рювали на проточному УФ-спектрофотометрі HM/Holochrome (фірми "Gilson", Фран­ція) за довжини хвилі 216 нм.

Молекулярні маси компонентів фракцій визначали за графіком, для побудови якого використовували маркери ^І-фенілаланіну, глутамілтриптофану, лейциненкефалі-ну, окситоцину, бомбезину (фірми "Sigma", USA ) аналогічно до методики [12]. Кислот­ний гідроліз препаратів виконували 6 н НС1 при температурі 110°С упродовж 24 год відповідно до стандартної методики [1]. Після гідролізу проби випарювали на роторно­му випарнику (фірми "Rotadest" Угорщина).

Амінокислотний склад продуктів гідролізу і вміст вільних амінокислот церебралу визначали на амінокислотному аналізаторі типу Т-339 (фірми "Мікротехн", Чехословач-чина). Використовували колонки, заповнені сульфополістирольною іонообмінною смо­лою "Oston LgANB" у Li-цитратному буфері. Застосовували східчасте елюювання аміно­кислот з колонки Li-цитратними буферами з рН 2,75±0,01, 2,95±0,01, 3,20±0,02, 3,80±0,02,

О. Макаренко, Н. Карандєєва, І. Васильєва

5,00±0,02; зразок гідролізату розводили Li-цитратним буфером із рН 2,2. Температура термостатування колонки становила 38,5 та 65°С. Амінокислоти, що містяться в окремих фракціях, детектували за допомогою розчину нингідрину на проточному фотометрі за довжини хвилі 560 нм. Кількісно хроматограми досліджуваного зразка оцінювали порів­нянням з хроматограмою стандартної суміші амінокислот (фірми "BioRad", USA).

Біологічні дослідження виконували на самцях білих пацюків лінії Вістар масою 180-210 г. Використали десять груп, кожна з яких складалася з шести тварин: група 1 -контроль (інтактні тварини); група 2 - псевдооперовані тварини; група 3 - інтактні тва­рини + церебрал, інтраназально, протягом двох діб; група 4 - інтактні тварини + цереб-рал, інтраназально, протягом шести діб; група 5 - пацюки через дві доби після відтво­рення ГІ; група 6 - пацюки через шість діб після ГІ; група 7 - тварини з ГІ + церебрал, інтраназально, протягом двох діб; група 8 - тварини з ГІ + церебрал, інтраназально про­тягом шести діб; група 9 - тварини з ГІ + церебрал, інтраперитоніально, протягом двох діб; група 10 - тварини з ГІ + церебрал, інтраперитоніально, протягом шести діб.

Автогеморагічний інсульт моделювали за допомогою стереотаксиса шляхом руй­нування тканини головного мозку металевим мандреном (у ділянці interna dextra et sinistra) і наступної ін'єкції 100 мкл автокрові шприцом. Морфоконтроль ділянки вра­ження виконували на пофарбованих за методом Нессля фронтальних зрізах мозку.

Сумарну РНК із мозку пацюка визначали фенолхлороформним методом; гібридиза­цію проводили з використанням 32Р-міченого зонду cgccttgacaaaggtgtgagtcgtggtgcagtatgagttc ("Pharmacia Biotech") відповідно до стандартної процедури. Статистичну значимість похибок визначали з урахуванням р<0,05 (Ut) (Mann-Whitney).

У дослідженні розглянуто результати порівняльного вивчення складу: церебралу - безліпідного екстракту мозкової тканини; контрольного препарату, виготовленого з цереброкортексу свиней, яких не піддавали штучному геморагічному інсульту; препара­ту порівняння - церебролізину (комплекс пептидів, отриманий за допомогою фермента­тивного гідролізу мозку свині).

Усі три препарати містять незначну кількість білка і високомолекулярних пепти­дів з молекулярною масою понад 3000 Да, мг/1 мл ампульного розчину: церебрал -0,39; церебрал К - 0,32, церебролізин -0,48. Відсотковий вміст білка в церебралі і конт­рольному препараті щодо сухої маси не перевищує 3,5%.

Нуклеїнових кислот і їхніх фрагментів у препаратах не виявлено. Оскільки техно­логією виготовлення церебралу передбачене вивільнення від ліпідної фракції, у тому числі фосфоліпідів, то в препараті контролювали залишковий вміст фосфору. Результа­ти елементного аналізу наведені в табл. 1.

Дослідження складу лікарської форми препарату церебрал методом гель-фільтрації на сефадексі G-15 дає такий молекулярно-масовий розподіл компонентів: церебрал складається з чотирьох-п' яти пептидних фракцій, молекулярні маси яких є в

Таблиця 1

Елементний склад церебралу, контрольного препарату та церебролізіну

Препарат

Вміст елемента, %

 

C

H

N O

S

P

Церебрал Контрольний Церебролізин

55,16 55,72 54,88

7,23 7,14 7,44

16,76 20,83

15,90 21,24

16,58 21,02

0,011 0,005 0,0083

0,0002

0,0003 нема

діапазоні 330-1500 Дa, і набору вільних амінокислот. Серед пептидів переважають ре­човини з молекулярною масою близько 1250-1350, 1180, 1070, 680, 370 Да. Високомо-лекулярних пепетидів з молекулярною масою від 1500 до 6000 Да - до 18%. Кількість вільних амінокислот у препараті, за даними амінокислотного аналізу, не перевищує в середньому 7% (головно, аспарагінова, глутамінова і гамма-аміномасляна кислоти).

Молекулярно-масовий розподіл контрольного препарату відрізняється від розпо­ділу церебралу: у спектрі нема фракції з молекулярною масою 1250-1350, кількісне співвідношення високомолекулярні пептиди-низькомолекулярні зміщене убік як 57:35, вміст вільних амінокислот - до 8% (див. рисунок). Отже, на цьому етапі простежується якісне розходження в здатності травмованої тканини мозку накопичувати індивідуальні низькомолекулярні речовини.

Фракції з молекулярною масою 1250 Да піддали кислотному гідролізу. Результа­ти амінокислотного аналізу церебралу і контрольного препарату, наведені в табл. 2, сві­дчать про високий вміст глутамінової й аспарагінової кислот, аліфатичних амінокислот (гліцину й аланіну), оксиамінокислот (серину). З іншого боку, зафіксовано низький вміст ароматичних амінокислот і наявність гамма-аміномасляної кислоти.

Зазначені вище особливості характерні для білково-пептидно-амінокислотного складу мозку вищих ссавців і побічно свідчать про ендогенне походження антиінсульт-ного трофінотропного чинника церебралу. З огляду на це можна вважати, що антиінсу-льтна дія церебралу зумовлена наявністю в препараті специфічного комплексу трофіно-тропних регуляторних пептидів з невеликою молекулярною масою.

Порівняння результатів біологічної активності церебралу в групах досліджуваних тварин дала змогу виявити таке: у 40% пацюків п'ятої групи (ГІ, дві доби після моделю­вання патології) і в 100% тварин шостої групи (ГІ, шість діб) наявна мРНК ФРН. Анти-інсультна дія церебралу протягом перших двох і шести діб багато в чому зумовлена системою постачання низькомолекулярних речовин препарату в мозок. У разі інтрана-зального введення церебралу у тварин з ГІ протягом двох діб      2 ■ (сьома група) значно прискорюва­лася експресія мРНК ФРН, що д детектована в мозку кожної твари­ни. Її середній рівень статистично вірогідно перевершував відповід­ний показник експериментальних не лікованих церебралом пацюків і становив 0,74 пмоль мРНК ФРН/ мг РНК, Ut, р = 0,051. Інтраназа-льный шлях уведення препарату завдяки механізму ретроградного аксонного транспортування моле­кул дає змогу прискорити експре­сію мРНК ФРН і синтез у кліти­нах мозку ФРН в разі гострого ГІ. Да

Цей трофінотропний ефект цереб- Молекулярно-масовий розподіл церебралу (1) та контро­ралу зберігається у тварин вось- льного препарату (2): Да - молекулярна маса фракції, Да; мої групи: мРНК ФРН виявляєть- А - оптична густина.

Таблиця 2

Амінокислотний склад фракції 1250 Да церебралу і контрольного препарату

Амінокислота

М±т%

 

Церебрал

контрольний препарат

Глутамінова кислота та глутамін

21,6±0,8

16,4±0,7

Гліцин

15,2±0,6

11,4±0,5

Аспарагінова кислота та аспарагін

18,6±0,7

14,2±0,6

Серин

13,1±0,5

9,4±0,5

Аланін

8,3±0,4

11,7±0,5

Лізин

6,8±0,2

9,4±0,5

Валін

4,3±0,2

8,1±0,4

Пролін

2,5±0,1

4,9±0,3

Лейцин

1,2±0,1

4,5±0,2

ГАМК

4,9±0,3

4,1±0,2

Фенілаланін

1,7±0,1

2,9±0,1

Тирозин

0,8±0,05

2,1±0,1

Цистеїн

0,4±0,02

0,2±0,02

ся в мозку всіх тварин і становить 0,25 пмоль мРНК ФРН/мг РНК, Ut, р = 0,043. У разі використання інтраназального шляху введення в інтактних тварин протягом двох і шес­ти діб (третя і четверта групи) церебрал не чинить впливу на молекулярний механізм збільшення рівня ФРН у мозку пацюків, на відміну від різко вираженої експресії мРНК ФРН у тварин з експериментальним ГІ. Експресія мРНК ФРН у тканинах мозку пацюків дев' ятої групи детектована у 40% тварин, а на шосту добу (десята група) інтраперитоні-ального введення церебралу - у всіх тварин. Концентрації мРНК ФРН, що становили відповідно, 0,15 і 0,26 пмоль мРНК ФРН/мг, наближалися до показників, що їх мали тварини на шосту добу ГІ, значно перевершуючи аналогічні показники у інтактних па­цюків.

Отже, можна бачити, що трофінотропін церебрал збільшує синтез і секрецію ФРН в умовах експериментальної паталогії, не впливаючи на процеси в інтактних тварин, що свідчить про наявність нейроактивувальної дії препарату церебрал у гострому періоді ГІ.

Препарат є комплексом білків, низькомолекулярних пептидів і вільних амінокис­лот. Елементний склад церебралу, контрольного препрарату і церебролізину близький.

Молекулярно-масовий розподіл церебралу має декілька фракцій: високомолеку-лярні пептиди, низькомолекулярні пептиди, амінокислоти. У церебралі і контрольному препараті визначене різне співвідношення високомолекулярної і низькомолекулярної пептидних фракцій за однакового вмісту вільних амінокислот.

Кількісний амінокислотний аналіз засвідчив підвищення концентрації у виділе­ній низькомолекулярній фракції 1250 Да аспарагінової, глутамінової кислот, гліцину, аланіну і серину порівняно з контрольним препаратом.

Церебрал активує синтез і секрецію ФРН у разі експериментального гострого гемора­гічного інсульту і поряд з цим не впливає на синтез і секрецію ФРН у контрольних тварин.

Інтраназальний шлях уведення церебралу є оптимальним для подолання трофіно-тропіном гематоенцефалічного бар' єра.

1. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М.: Наука, 1976. 496 с.

2. Макаренко О.М., Корольов Ю.Н. Засіб "Церебрал" для лікування інсульту та спосіб його отримання / Патент України № 24299 від 07.07.1998, МКИ А61К 35/30.

3. ОстерманЛ. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. 341 с.

4. Палладин А.В., Белик А.В., Полякова Н.М. Белки головного мозга и их обмен. Киев:

Наук. думка, 1972. 274 с.

5. Awatsuji H., Furukama Y., Hirota M. at al. Interleikin -4 and -5 as modulators of nerve growth factor syntesis/secretion in astocytes // J.Neurosci.Res. 1993. Vol. 539. P. 34-40.

6. Dickon D.W.; Lee S.C.; Brosnan C.F. at al. Neuroimmunology of Aging and Alzheimer's disease with Emphasis on Cytokines // Ransohoff, R.M.; Benveniste, E.N., eds. Cytokines and the CNS, New York-London-Tokyo: CRC Press, 1996. P. 239-267.

7. Griffin D.E., McArtur J.C., Cornblath D.R. Soluble IL-2 receptor and soluble CD9 in serum and cerebrospinal fluid during HIV virus - associated neurologic disease // J.

Neuroimmunol. 1990. Vol. 97. P. 28-33.

8. Miller M.D., Krangel M.S. Biology and biochemistry of the chemokines: A family of chemotatic and inflamatory cytokines // Crit. Res. Immunol. 1992. Vol. 17. P. 12-18.

9. Pickart L., Thayer L., Thaler MM.Neurotropic factor during virus - associated neurologic disease // Biochem.biophys. Res. Commun. 1973. Vol. 54. P. 562-566.

10. Ransohoff R.M., Benveniste E.N. Cytokines and the CNS. New York-London-Tokyo:

CRC Press, 1996. 215 p.

11. Schlesinger D.H., Pickart L., Thaler M.M. Expression of ciliari neurotropic factor and the neurotrophins -NGF brain derived neurotropic factor and neurotrophin 3 - in cul­tured rat hippocampal astrocytes // Experientia. 1977. Vol. 33. P. 324-325.

12. Voon Wee Young. Cytokines, Astroglosis and Neurotrophism following CNS Trauma // Ransohoff, R.M.; Benveniste, E.N., eds. Cytokines and the CNS. New York-London-Tokyo: CRC Press, 1996. P. 309-327.

13. Weitzel G., Bauer F.-U., Eisele K. Endogenous pharmacological studies of neurotrophi-notropine factors // Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 1976. Vol. 357. P.187-200.

STUDYING OF THE CHEMICAL COMPOUND AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF THE PREPARATION TROPHYNOTROPINES GROUP- CEREBRAL

A. Makarenko*, N. Karandyeyeva**, I. Vasilyeva*

* Institute of Neurosurgery А.P.Romodanov's AMS of Ukraine, Manuilskogo str., 8, Kyiv 03022, Ukraine e-mail: ira@neuro.ua ** CАC "Dneprofarm", Karl Marx av. 12, Dnipropetrovsk, Ukraine e-mail: dp@dneprofarm.ua

Chemical compound of Cerebral - the first representative of lines tro-phynotropine preparations of a brain is investigated. It is established, that the preparation represents a complex composition of free amino acids, low-molecular peptides and proteins. The basic components are peptides with mo­lecular weights 680-1350 Da. In peptide fractions Cerebral prevail glutamic, aspartic aminoacids, alanine, glycine, serine. It is supposed, that highly effective antistroke action is caused by presence in a preparation of a specific complex trophynotropic upregulative peptides with small molecular weight.

Key words: neurotropins, low-molecular peptides, antistroke preparation.

Стаття надійшла до редколегії 01.03.2005 Прийнята до друку 29.05.2005

Страницы:
1 


Похожие статьи

церебралу - Вивчення хімічного складу і біологічної активності препарату групи трофінотропінів