І Вовчук, С Петров - Виділення та очищення трипсиноподібних протеїназ із тканини немалігнізованого яєчника - страница 1

Страницы:
1 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF L'VIV UNIV.

Серія біологічна. 2007. Вип. 43. С. 96-105       Biology series. 2007. Is. 43. P. 96-105

УДК 577.152.344:577.15.072

ВИДІЛЕННЯ ТА ОЧИЩЕННЯ ТРИПСИНОПОДІБНИХ ПРОТЕЇНАЗ ІЗ ТКАНИНИ НЕМАЛІГНІЗОВАНОГО ЯЄЧНИКА

І. Вовчук, С. Петров

Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова Шампанський провулок 2, м. Одеса 65058, Україна e-mail: irvov@ukr.net

Розроблено методику виділення та очищення трипсиноподібних про-теїназ, що складається з поступового осадження сульфатом амонію та гель-хроматографії на сефадексах G-75 та G-100. З'ясовано, що поступове оса­дження сульфатом амонію сприяє ефективнішому розподілу трипсиноподіб­них ферментів. Подальше очищення препаратів протеїназ методом гель-хроматографії приводить до збільшення активності трипсиноподібних фер­ментів, відсотка виходу та коефіцієнта їхнього очищення, однак негативно впливає на стабільність протеїназ.

Ключові слова: трипсиноподібні протеїнази, виділення ферментів, гель-хроматографія.

У попередніх дослідженнях ми виявили підвищення активності трипсиноподібних протеїназ у пухлинах яєчників порівняно з немалігнізованою тканиною [1, 2,]. Вивчення механізмів регулювання активності цих протеолітичних ферментів як на молекулярному, так і на тканинному рівні та порівняльні дослідження біохімічних властивостей трипсино-подібних протеїназ немалігнізованої та пухлинних тканин можливі тільки в разі отримання їх в очищеному стані. Оскільки в сучасній літературі ми не знайшли інформації' щодо виді­лення та очищення препаратів трипсиноподібних протеїназ із тканини немалігнізованого яєчника, то мали на меті розробити метод виділення й очищення препарату трипсиноподіб-ної протеїнази для подальшого вивчення її фізико-хімічних та біохімічних властивостей.

Тканину немалігнізованого яєчника гомогенізували в дистильованій воді у співвід­ношенні 1:10 і центрифугували при 9 000 g (при +4оС) протягом 45 хв. Осад ресуспенду-вали в дистильованій воді в співвідношенні 1:5, гомогенізували в аналогічних умовах, а супернатанти об'єднували. Отриманий білковий розчин діалізували проти 40 об'ємів дис­тильованої води при +4оС протягом 12 год. Поступове фракційне осадження робили суль­фатом амонію, насичуючи білковий розчин до 20, 40, 60 та 80%. Кожну фракцію діалізу-вали за аналогічних умов та надалі використовували в хроматографічних дослідженнях. Хроматографію виконували на сефадексах G-75 та G-100 (2,0^8,0 см). Елюцію проводи­ли дистильованою водою, 0,05 М оцтовокислим цинком (рН 5,2) та плавним градієнтом NaCl. Молекулярні маси визначали за методом Ендрюса [4], використовуючи маркерні білки ("Serva" Швеція): білок сироватки людини - 66 500 Да, овальбумін - 43 000 Да, хімотрипсиноген А - 25 000 Да, лізоцим - 17 500 Да, РНК-аза - 13 700 Да. Активність трипсиноподібних протеїназ визначали за гідролізом 2% казеїну [6] у прирості оптичної щільності в разі 750 нм за 1 хв інкубації при 37оС, питому активність - у перерахунку на 1 мг білка. Вміст білка визначали спектрофотометричним методом при 280 нм та за мето­дом Лоурі [7].

Статистичну значимість відмінностей між вибірками виявляли за допомогою кри­терію Стьюдента [5].

© Вовчук І., Петров С., 2007

Експериментальним шляхом визначено, що діаліз - найпоширеніший метод очи­щення білкових розчинів від низькомолекулярних сполук - не приводить до збільшення питомої активності ферменту (див. таблицю). З подальшим поступовим осадженням біл­ків сульфатом амонію зафіксовано не менш ніж чотири фракції трипсиноподібних проте-їназ, які осаджувалися за різних ступенів насичення (див. таблицю). Щодо показників діалізованого розчину білка, то при 20% насиченні сульфатом амонію осаджується 7,14% загального білка та 10,07% ферментативної активності. Загальна активність трипсинопо­

Активність трипсиноподібних протеїназ на етапах виділення та очищення (M±m; n = 4)

Етап виділення

Об'єм, мл

Білок, мг/мл

Активність*,

АЕ750

Питома акти­вність, АЕ750/ мг білка

Загальна активність,

V х АЕ750

Коефіцієнт очищення

%

виходу

Вихідний

 

 

 

 

 

 

 

розчин білка

36,0±3,20

112,0±7,4

0,0320±0,002

0,286±0,03

1,152±0,118

 

 

Хроматографія

 

 

 

 

 

 

 

на G-75:

 

 

 

 

 

 

 

Нанесено

2,5±0,27

280,0±28,2

 

 

0,080±0,007

1,00

100,00

Пік I

20,0±1,82

1,3±0,131

0,0015±0,0002

1,154±0,118

0,030±0,002

4,03

37,50

Розчин білка

 

 

 

 

 

 

 

після діалізу

36,0±2,19

98,0±6,1

0,0240±0,003

0,245±0,016

0,864±0,09

1,00

100,00

20% насичення

 

 

 

 

 

 

 

(NH4)2SO4

6,2±0,53

7,0±0,4

0,0140±0,002

2,000±0,152

0,087±0,009

8,16+

10,07+

Хроматографія

 

 

 

 

 

 

 

на G-75:

 

 

 

 

 

 

 

Нанесено

2,5±0,3

17,5±1,42

 

 

0,035±0,004

1,00

100,00

Пік I

20,0±1,93

1,5±0,131

0,0006±0,00001 0,400±0,032

0,012±0,001

0,20

34,29

40% насичення

 

 

 

 

 

 

 

(NH4)2SO4

8,4±0,72

48,0±3,12

0,0120±0,002

0,250±0,019

0,101±0,009

1,02+

11,69+

Хроматографія

 

 

 

 

 

 

 

на G-75:

 

 

 

 

 

 

 

Нанесено

2,5±0,21

120,0±11,7

 

 

0,030±0,002

1,00

100,00

Пік I

15,0±1,37

2,00±0,18

0,0667±0,007

33,350±2,970

1,005±0,08

133,40

3350,00

60% насичення

 

 

 

 

 

 

 

(NH4)2SO4

7,2±0,61

40,0±3,21

0,0100±0,009

0,250±0,0137 0,072±0,006

1,02+

8,33+

Хроматографія

 

 

 

 

 

 

 

на G-100:

 

 

 

 

 

 

 

Нанесено

5,0±0,44 200,0±18,23

 

 

0,050±0,004

1,00

100,00

Пік I

20,0±1,84

6,0±0,53

0,0108±0,008

1,800±0,136 0,216±0,0195

7,20

432,00

Пік II

15,0±1,37

8,0±0,62

0,0057±0,0006

0,713±0,063

0,086±0,009

2,85

172,00

80% насичення

 

 

 

 

 

 

 

(NH4)2SO4

24,0±1,38

5,0±0,34

0,0070±0,006

1,400±0,129

0,168±0,014

5,71+

19,44+

Хроматографія

 

 

 

 

 

 

 

на G-75:

 

 

 

 

 

 

 

Нанесено

15,0±1,29

75,0±6,38

 

 

0,105±0,009

1,00

100,00

Пік I

10,0±0,84

0,9±0,07

0,0015±0,0002

1,667±0,181

0,015±0,003

1,19

14,29

Пік II

10,0±0,92

1,3±0,119

0,0155±0,0018

11,923±1,114 0,155±0,017

8,24

147,62

Всього:

 

 

 

 

 

 

49,53+

Примітка. Активність виражали у значеннях приросту екстинкції за довжини хвилі 750 нм за 1 хв інкубації; + Коефіцієнт очищення та відсоток виходу ферменту щодо показників білкового розчи­ну, отриманого після діалізу.

І. Вовчук, С. Петров

дібних ферментів цієї фракції знижується в 1,71 раза, проте питома активність та коефіці­єнт очищення збільшуються в 8,16 раза, що свідчить про втрату під час фракціонування факторів, які регулюють ферментативну активність, серед яких можуть бути ендогенні інгібітори трипсиноподібних протеїназ. Щодо показників діалізованого розчину білка, прийнятих за 100 відсотків, то в разі 40 та 60% насичення сульфатом амонію осаджується 48,9 і 40,80 загального білка та визначають 11,69 і 8,33% ферментативної активності (співвідносно), однак питома активність цих фракцій не відрізняється від показників діа-лізованого розчину білка. Найбільший відсоток виходу трипсиноподібних ферментів -19,44 - отримано в разі 80% насичення сульфатом амонію з коефіцієнтом очищення 5,71 раза. Загалом у випадку поступового осадження сульфатом амонію відсоток виходу трип-синоподібних ферментів становив 49,53% щодо діалізованого розчину білка. Отримані результати незначно відрізняються від літературних даних [4], їх можна пояснити не­значною деградацією під час проведення фракціонування та діалізу.

Подальше очищення трипсиноподібних протеїназ методом гель-хроматографії дало змогу очистити фракції трипсиноподібних протеїназ від 1,19 до 133,4 раза з вихо­дом ферменту від 14,29 до 3350,0%. Наприклад, цим методом виявлено, що значна кіль­кість водорозчинних білків вихідного розчину представлена як високомолекулярними білками з молекулярною масою від 63,5 до 43,0 кДа, так і низькомолекулярними пепти­дами, які вимиваються з сефадексу плавним градієнтом NaCl (рис. 1). Коефіцієнт очи­щення трипсиноподібних протеїназ, які визначені в єдиному білковому піку з молекуляр­ною масою 20185,80 Да, становив 4,03, а відсоток виходу - 37,5 (рис. 2, таблиця).

На відміну від результатів, отриманих у разі 20% осадження сульфатом амонію, пода­льше очищення хроматографічним методом призводило до значної втрати і загальної, і пито­мої активності ферменту (рис. 3, таблиця). Це можна пояснити тим, що значна кількість трипсиноподібних ферментів, яка містилася в фракції, осадженій сульфатом амонію, перебу­вала в активованій формі й під час хроматографії значно самогідролізувалася.

Навпаки, метод хроматографії дав змогу додатково очистити фракцію, отриману в разі 40% осадження сульфатом амонію, в 133,4 раза з виходом ферменту 3350,0%, а молекулярна маса була ідентичною молекулярній масі ферменту з вихідного розчину (див. рис. 2, 4, таблиця). Такі значні показники відсотка виходу та коефіцієнта очищен­ня можна пояснити вірогідною наявністю ендогенного інгібітора трипсиноподібних протеїназ, що наявний в осаджуваній фракції і відокремлюється під час хроматографії. На користь цього припущення свідчать результати, отримані нами в попередніх дослі­дженнях [1, 2].

Хроматографічним методом на сефадексі G-100 серед білків, осаджених у разі 60% насичення сульфатом амонію, зареєстровано два білкові піки з трипсиноподібною актив­ністю. Вихід білка з молекулярною масою 30224,76 Да, що був очищений у 7,2 раза, ста­новив 432,0%. Інший трипсиноподібних фермент з молекулярною масою 9003,47 Да був очищений в 2,85 раза і вимивався 0,06 М NaCl (рис. 5, таблиця).

Отримані результати свідчать про те, що під час хроматографії певна кількість ферменту була деградована без порушення активного центру. Хроматографічне дослі­дження фракції білків 80% осадження сульфатом амонію дало змогу виявити два фермен­тативні піки з коефіцієнтами очищення в 1,19 та 8,24 раза і виходом ферменту 14,29 та 147,62%, відповідно (рис. 6, таблиця). Молекулярна маса білків першого піка дуже подіб­на до молекулярної маси ферментів, отриманих з фракцій вихідного розчину, фракції розчинів 20 та 40% насичення сульфатом амонію (див. рис. 2).

Рис. 2. Визначення молекулярних мас трипсиноподібних протеїназ методом гель-фільтрації на сефадексі G-75: 1 - альбумін сироватки людини (молекулярна маса 66 500 Да); 2 - оваль-бумін (молекулярна маса 43 000 Да); A - фермент, отриманий після хроматографії фракції 60% осадження сульфатом амонію (пік I, молекулярна маса 30 224,76 Да); 3 - хімотрипси-ноген А (молекулярна маса 25 000 Да); B - фермент, отриманий після хроматографії фра­кції 20% осадження сульфатом амонію (молекулярна маса 21 017,35 Да); C - фермент, отриманий після хроматографії фракції 80% осадження сульфатом амонію (пік I, молеку­лярна маса 21 017,35 Да); D - фермент, отриманий після хроматографії вихідного розчину (молекулярна маса 20 185,80 Да); E - фермент, отриманий після хроматографії фракції 40% осадження сульфатом амонію (молекулярна маса 20 185,80 Да); 4 - лізоцим (молекулярна маса 17 500 Да); 5 - рибонуклеаза (молекулярна маса 13 700 Да); F - фер­мент, отриманий після хроматографії фракції 80% осадження сульфатом амонію (пік II, молекулярна маса 13 481,18 Да); G - фермент, отриманий після хроматографії фракції 60% осадження сульфатом амонію (пік II, молекулярна маса 9 003,47 Да).

(«і яу) евнтзхосЬі хиндіїґопониописіх чхэгаяихлу

(0si3v) ЕЕЩЭхосш хиндіїґопониописії чхэшяихяу

(о"hv) EBHiabodn хиндіїґопониописіх чхэшяихлу

Отже, на відміну від традиційного двостадійного осадження сульфатом амонію (0-40 та 40-80% насичення сульфатом амонію [4]), поступове осадження сприяє ефективнішому розподілу трипсиноподібних ферментів. Водночас гель-хроматографія дає значно більший ефект додаткового очищення трипсиноподібних ферментів фракції, отриманої 40% осадженням сульфатом амонію, що можна пояснити наявністю ендоген­ного інгібітора трипсину в цій фракції. Подальше очищення фракцій 60 та 80% насичен­ня сульфатом амонію методом гель-хроматографії приводить до збільшення відсотка виходу та коефіцієнта очищення трипсиноподібних протеїназ, однак наявність двох білкових піків у кожному випадку свідчить про їхню швидку деградацію.

1. Вовчук И. Л., Бендерская Н. В. Активность протеиназно-ингибиторной системы у женщин с онкозаболеваниями яичников // Девятая конференция Пущинского науч. центра РАН. М., 2000. Т. 1. С. 87.

2. Вовчук И. Л., Бендерская Н. В., Чернадчук С. С., Мортук Н. В. Тканевые протеиназы опухолей яичника и матки // Вестн. Таврич. ун-та. 2001. Т. 14 (53). № 2. С. 17-20.

3. КретовичВ. Л. Введение в энзимологию. М.: Наука, 1974. 350 с.

4. Практическая химия белка. М.: Мир, 1989. С. 39-43.

5. Рокицкий П. Ф. Биологическая статистика. Минск: Высшая школа, 1967. 326 с.

6. Kunitz M. I. The determination of kaseine in the blood and urine // Biol. Chem. 1946. Vol. 164. P. 563-571.

7. Lowry O. H., Rosenbrough N. J., Farr F. Z., Randal L. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

EXTRACTING AND PURIFICATION OF TRYPSINALIKE PROTEINASES FROM THE TISSUES OF NON-MALIGNIZED OVARIUM

I. Vovchuk, S. Petrov

1.1. Mechnikov National University of Odessa Shampansky st. 2, Odessa 65058, Ukraine e-mail: irvov@ukr.net

The method of extracting and purification of trypsinalike proteinases which consists of step-by-step ammonium sulfate sedimentation and gel-chromatography on Sefadex G-75 and G-100 was obtained. It was studied that step-by-step ammonium sulfate sedimentation increases the effect of trypsi-nalike enzymes division. Further clearing of the proteinase samples with gel-chromatography method leads to activity increasing of trypsinalike enzymes, of percent of exiting and the coefficient of their purification, but has a negative influence on the proteinase stability.

Key words: trypsinalike proteinases, enzyme extracting, gel-chromatography.

Стаття надійшла до редколегії 22.03.06 Прийнята до друку 15.04.06

Страницы:
1 


Похожие статьи

І Вовчук, С Петров - Виділення та очищення трипсиноподібних протеїназ із тканини немалігнізованого яєчника