В Рішко - Вплив генів-модифікаторів dad і tkv на фенотиповий прояв мутацій гена дистрофіну - страница 1

Страницы:
1  2 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF L VIV UNIV.

Серія біологічна. 2009. Вип. 51. С. 55-62 Biology series. 2009. Is. 51. P. 55-62

УДК 595.773.4:575'113'224.4:591.139

ВПЛИВ ГЕНІВ-МОДИФІКАТОРІВ DAD І TKV НА ФЕНОТИПОВИЙ ПРОЯВ МУТАЦІЙ ГЕНА ДИСТРОФІНУ У DROSOPHILA MELANOGASTER

В. Рішко, О. Побережник, М. Кучеренко, Н. Голуб, Д. Максимів, Я. Черник

Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського, 4, Львів 79005, Україна e-mail: yacher@mail.ru

Гени Dad та tkv належать до групи генів, задіяних у Dpp-сигнальному шляху. Для вивчення їх впливу на функціонування гена дис-трофіну Drosophila melanogaster одержано особини, що в одному організмі містили досліджуваний ген-модифікатор і генетичну конструкцію для ін­активації гена дистрофіну. В результаті аналізу таких гібридів виявлено відновлення структури вен крила, порушення якої є характерною ознакою мутантів за геном дистрофіну. Пенетрантність прояву досліджуваних генів-модифікаторів становила 30,5-48,5% у потомків від схрещування лінії Dad з мутантами за геном дистрофіну та 2-8% у особин від схрещування лінії tkv з тими ж мутантами. Також показано, що гени Dad і tkv зумовлюють часткове відновлення структури м'язів тораксу. Ген Dad виявився більш активним супресором мутантного дистрофінового фенотипу порівняно з геном tkv.

Ключові слова: дрозофіла, дистрофін, гени-модифікатори, Dad, tkv.

З'ясування причин і механізмів виникнення м'язових дистрофій у людини є одні­єю з найактуальніших проблем біології та медицини, оскільки такі захворювання нале­жать до категорії невиліковних. В основі їхнього розвитку лежать порушення у структу­рі та функціонуванні дистрофін-глікопротеїнового комплексу (ДГК).

ДГК виявлений у різних типах клітин. Основною його функцією є передача сиг­налів із позаклітинного простору всередину клітини [9].

У людини описано кілька видів міопатій. Серед них найважчою є м'язова дистро­фія Дюшена, яка спричинює поступову деградацію м'язів. Це захворювання трапляєть­ся з частотою 1:3500 і вражає, головно, чоловіків. В осіб, які страждають від цієї хворо­би, деградація м'язів починається у віці від 6 років і прогресує до смерті, яка настає в молодому віці. Причиною розвитку цього захворювання найчастіше є делеції в гені дис-трофіну, який міститься в Х-хромосомі. Дистрофін є складовою частиною ДГК [8].

На жаль, на даний час мало відомо про молекулярні механізми, які спричинюють розвиток міопатій. М'язові дистрофії супроводжуються не лише деградацією м'язів, але часто і порушеннями у функціонуванні структур головного мозку. На сьогодні такі за­хворювання лікуються лише симптоматично. Для часткової корекції гена дистрофіну у людей із м'язовою дистрофією Дюшена (МДД) та Беккера (МДБ) застосовують геноте-рапевтичні підходи [8].

Метою роботи було дослідити здатність генів Dad і tkv D. melanogaster впливати на мутантний фенотип за геном дистрофіну у ліній tg6 та tg4.

Матеріалом досліджень служили високоінбредні лабораторні лінії Drosophila melanogaster, отримані з університету Дж. Вашингтона (м. Сіетл, США): tg4 (tg4tubGal4/TM6B,Tb), tg6 (dsDys(tg6)tubGal4/TM6B,Tb). Дані лінії були сконструйовані з використанням антисенс-РНК до N- та до C-кінця мРНК дистрофіну [9]. Лінія tg6 ха-

© Рішко В., Побережник О., Кучеренко М. та ін., 2009рактеризується відсутністю синтезу усіх ізоформ дистрофіну на 70%, тоді як у лінії tg4 синтезуються лише короткі ізоформи. Також було використано лінії Dad (Dad[j1E4]/ TM6B,Tb), tkv (tkv[16713]/Cy0) і лінія дикого типу Oregon.

Для дослідження тривалості життя мух дикого типу та досліджуваних мутантних ліній проводився тест на виживання з подальшою побудовою і аналізом кривих вижи­вання. Для цього самців віком одна-дві доби розсаджували у дрозофільні стаканчики по 10 імаго в кожному. Кожен із варіантів експерименту включав по 10 повторів (стаканчиків), у яких в сукупності налічувалося по 100 комах. Підрахунок живих мух і пересадку на свіже поживне середовище проводили раз у 3 дні без ефіризації. Після закінчення експерименту визначали показники середньої тривалості життя (СТЖ) і мак­симальної тривалості життя (МТЖ). Показники середньої тривалості життя визначали за такими параметрами: S75 - термін (у добах), на котрий залишаються живими 75% мух; S50 - 50% мух; S25 - 25% мух. Виготовлення гістологічних препаратів м'язів торак­су D. melanogaster проводили згідно з методикою Хейзенберга і Боля [5]. Фарбування препаратів зрізів тораксу гематоксилін-еозином здійснювали згідно з методикою Майєра [1]. Отримані препарати аналізували у видимому світлі з використанням об'єктива 20- і 40-кратного збільшення на мікроскопі Loboval 3 Carl Zeiss - Jena. Стати­стичну обробку отриманих даних проводили з використанням функцій і пакету аналізу даних програми Microsoft Excel.

Хорошим модельним об'єктом для дослідження молекулярно-генетичних основ виникнення міопатій є D. melanogaster. Попередні дослідження виявили, що у дрозофі­ли наявні гомологи всіх компонентів, які входять до складу дистрофін-глікопротеїнового комплексу; при цьому вони проявляють високий ступінь подібності до відповідних структур людини [1, 3, 9]. У той же час було визначено 37 генів, які мо­жуть виступати модифікаторами функціонування ДГК [6]. Це гени, задіяні у функціонуванні м'язів і цитоскелета (Cam, nAcRa-30D); міграції нейронів і визначенні клітинної полярності (sema, sli, robo); залучені у Notch(notch); Dpp(Dad, tkv, dpp); EGFR (kek, argos) сигнальних шляхах, а також гени posh, kis, gam, vimar [6].

Гени Dad і tkv Dpp-сигнального шляху задіяні в морфофізіологічних процесах. Dpp-сигнальний шлях контролює формування імагінальних дисків дрозофіли. Градієнт білка Dpp відповідає за індукцію дорзо-вентральної полярності тіла дрозофіли, а також бере участь у морфогенезі крила [2]. У клітинах, які несуть рецептори до білка Decapen-taplegic (Dpp), залежно від його концентрації, відбувається експресія генів, що відпові­дають за правильне утворення імагінальних дисків і подальше формування пластинки крила дрозофіли. Одним із таких рецепторів для морфогену Dpp є продукт гена tkv (Thickveins), який є посередником у трансдукції Dpp-сигналів у клітину. Мутації в гені tkv мають такий самий ефект, як і мутації у гені dpp, що свідчить про неможливість Dpp-сигналювання за відсутності рецепторів до білка Dpp. Продукт гена Dad є негативним регулятором Dpp-сигнального шляху. При високій концентрації білка Dpp у позаклітин­ному просторі цей сигнальний шлях здатен самоінгібуватися за рахунок синтезу білка Dad. Крім того, Dpp - сигнальний шлях, задіяний у каскадному процесі формування вен крила, а саме у визначенні місця, де можуть сформуватися вени [2].

У Drosophila під час розвитку крила формуються п'ять поздовжніх вен L1, L2, L3, L4, L5 та дві поперечні - передня (ACV) і задня (PCV) (рис. 1, А). Для лінії дикого типу Oregon характерною є завершеність поперечних жилок: ACV з'єднує L3 та L4, PCV - L4 та L5. У мутантів tg4 та tg6 розвиток PCV відбувається з порушенням і спри­чиняє формування вени, яка не торкається поздовжніх вен і може галузитися, крім того, можуть утворюватися додаткові жилки над L2 (рис. 1, Б, В) [6]. Цей фенотип спостері­гали з частотою 0,961±0,015 у особин лінії tg4 та з частотою 0,89±0,027 у мутантів tg6 (табл. 1).

Для аналізу модифікуючого впливу генів Dad і tkv Dpp-сигнального шляху на мутантний фенотип за геном дистрофіну було проведено схрещування ліній Dad та tkv, що містили додаткові копії генів-модифікаторів, з мутантами за геном дистрофіну. Як контроль використано вихідні лінії та лінію дикого типу Oregon. Серед потомків першо­го покоління отримано кілька генотипових класів. Із них відбирали особин з потрібним генотипом, тобто таких, які в одному організмі містили конструкцію, що блокує трансляцію дистрофіну, і одночасно ген-модифікатор. Аналізували таких потомків за фенотипом жилкування вен крила (рис. 2, табл. 1).

Так, від схрещування ліній Dadxtg4 у першому поколінні було отримано 154 осо­бини з потрібним генотипом, із них у 47 особин спостерігалося відновлення задньої поперечної вени крила (табл. 1, рис. 2, А). Частота таких потомків становила 0,305±0,037. Серед потомків від схрещування ліній Dadxtg6 було відібрано 132 особини з потрібним генотипом, 64 особини з яких мали відновлені вени крил (частота появи 0,485±0,043)(рис. 2, Б). Серед 100 потомків від схрещування tkvxtg4 було отримано 8 особин з відновленими венами крил (частота появи 0,08±0,027). Від схрещування ліній tkvxtg6 у першому поколінні отримали 100 гібридів з потрібним генотипом, із яких ли­ше 2 характеризувалися відновленим фенотипом (частота появи 0,02±0,014).

Отже, гени Dad та tkv певним чином супресують мутантний фенотип за геном дистрофіну. Досліджувані гени-модифікатори проявляють неповну пенетрантність. Так, пенетрантність гена Dad становила 30,5-48,5%, пенетрантність гена tkv у потомків від схрещувань ліній tkvxtg4 - 8%. Було виявлено, що ген tkv у особин від схрещування ліній tkvxtg6 не має супресорної сили і навіть спричиняє появу особин із відновленим фенотипом з нижчою (2%) частотою, ніж у вихідної лінії (11%). Отже, отримані дані свідчать про те, що значно активнішим супресором мутантного фенотипу за геном дис-трофіну за венами крил є ген Dad. Крім того, у частини мутантів першого покоління від схрещування лінії Dad із лініями tg4 та tg6 виявлено появу додаткових жилок (у 45 осо­бин серед 154 потомків від схрещування ліній tg4xDad і у 12 особин зі 132 від схрещу­вання tg6xDad), що свідчить про підсилення мутантного фенотипу (рис. 3, А, Б). Тобто гени Dad і tkv модифікують прояв жилкування крил шляхом як посилення мутантного, так і відновлення нормального фенотипу.

Рис. 1. Вени крила лінії дикого типу Oregon (А) і мутантів за геном дистрофіну - tg4 (Б) та tg6 (В). А - L1, L2, L3, L4, L5 - поздовжні вени, ACV та PCV - передня та задня поперечні вени, відповідно. Б, В - Стрілками позначено дефекти задньої поперечної вени крила (PCV) та додатково утворену вену над L2.

Таблиця 1

Аналіз потомків першого покоління за фенотипом вен крила

 

К-сть проана­лізованих потомків

К-сть особин з

К-сть особин з

Частота особин

Частота особин

F1

 

мутацією і геном

нормальним

з мутантним

з нормальним

 

 

модифікатором

фенотипом

фенотипом

фенотипом

Контроль tg4

154

154

6

0,961±0,015

0,039±0,015

Dadxtg4

550

154

47

0,695±0,037

0,305±0,037***

tkvxtg4

352

100

8

0,92±0,027

0,08±0,027*

Контроль tg6

132

132

15

0,89±0,027

0,11±0,027

Dadxtg6

438

132

64

0,515±0,043

0,485±0,043***

tkvxtg6

360

100

2

0,98±0,014

0,02±0,014***

Примітка. * - Вірогідність р>0,95, низька наявність ефекту (відновлення вен) порівняно з відпо­відним контролем. *** - Вірогідність р>0,999, статистично достовірна наявність ефекту (у особин від схрещування ліній tkvxtg6 відсутність ефекту) порівняно з відповідним контролем.

Відомо, що мутації в гені дистрофіну спричиняють у дрозофіли не тільки зміни полярності вен крила, але й скорочення тривалості життя та порушення структури м'я­зів [6]. Тому ми надалі дослідили виживання та параметри тривалості життя, а також структуру м'язів у мух зі супресією мутантного фенотипу.

Рис. 3. Вени крила у особин першого покоління від схрещування Dadxtg4 (Б) порівняно з вихід­ною лінією tg4 (А). Стрілками позначено додаткові вени крила.

Було очевидним припустити, що оскільки ген Dad є значно активнішим супресо-ром одного з фенотипових проявів мутацій гена дистрофіну (порушення вен крил), ніж ген tkv, то цей ген міг би позитивно впливати і на інший фенотиповий прояв - віднов­лювати порушену структуру м'язів. Було проведено аналіз гістологічних зрізів тораксу особин першого покоління від схрещування ліній tg6 і tg4 з мухами лінії Dad, які харак­теризуються відновленим фенотипом вен крила. Зрізи виготовляли на 12-й день після вильоту імаго. Відомо, що помітна дегенерація м'язів у мух з пошкодженим геном дис-трофіну розвивається саме на 12-й день життя дорослих особин D. melanogaster [9]. У особин ліній tg4 і tg6 спостерігаються дефекти у структурі м'язів (рис. 4, Б, В). Як вид­но з рис. 4, у м'язах мутантів за геном дистрофіну відбувається локальна втрата щільно­сті м'язових волокон і вакуолізація, що не характерно для особин дикого типу лінії Ore­gon цього ж віку (рис. 4, А). Ці лінії служили контролем у дослідженні впливу генів Dad і tkv на структуру м'язів у мутантів за геном дистрофіну.

Як видно з рис. 5, у м'язах тораксу особин першого покоління від схрещувань ліній Dadxtg4 та ліній Dadxtg6 з відновленими венами крил спостерігалося часткове

tg4 

А Б В

Рис. 4. Гістологічні зрізи непрямих літальних м'язів D. melanogaster (х200, х400). А - м'язи мух лінії дикого типу Oregon, Б і В - м'язи мутантів за геном дистрофіну - tg6 та tg4, відповід­но. Стрілками позначено дефекти у структурі м'язів - втрата щільності, вакуолізація.

А Б

Рис. 5. Гістологічні зрізи непрямих літальних м'язів особин першого покоління від схрещувань (х200, х400): А - tg4xDad, Б - tg6xDad. Стрілками позначено дефекти у структурі м'язів -втрата щільності, вакуолізація.відновлення структури м'язів. Отже, продукт гена Dad може супресувати фенотиповий прояв мутацій дистрофіну за венами крил і частково відновлювати структуру м'язів.

Побудовано криві виживання та проаналізовано параметри тривалості життя (рис. 6) (табл. 2) особин першого покоління від схрещувань tg4xDad, tg6xDad, tg4xtkv, tg6xtkv з метою перевірки здатності продуктів генів Dad і tkv впливати на тривалість життя особин, мутантних за геном дистрофіну. Як контроль використано лінію дикого типу Oregon та вихідні лінії. При аналізі кривих виживання особлива увага приділяється плато на кривій, наявність якого вважається характерною ознакою нормального старін­ня, а закінчення плато і перегин кривої свідчать про інтенсивне відмирання особин [7]. Особливо важливими є показники середньої тривалості життя (СТЖ), високі значення яких свідчать про підтримання періоду активної життєздатності.

1      4      7      10     13     16     19     22     25     28     31     34     37     40     43     46 49

Рис. 6. Криві виживання особин першого покоління від схрещувань tg4xDad, tg6xDad, tg4xtkv, tg6xtkv, порівняно з вихідними лініями та лінією дикого типу Oregon.

Як видно з рис. 6, у лінії дикого типу Oregon є чітке плато на кривій виживання, спад кривої спостерігається після 23-го дня життя імаго. Показники СТЖ становлять відповідно: S75 - 35,2±0,4 доби, S50 - 40,3±0,2 доби, S25 - 44,0±0,3 доби (табл. 2). Макси­мальна тривалість життя (МТЖ) дорівнювала 45±0,4 діб. Мутантні лінії tg4 і tg6 харак­теризувалися значно нижчими параметрами тривалості життя. Так, у них не спостерігалося плато на кривих виживання, особини масово відмирали вже на 2-4 день, а показники СТЖ становили: S75 - 3-4 доби, S50 - 5-7 діб та S25 - 6-8 діб, МТЖ у даних ліній досягала 10-22 діб. Такі ж низькі параметри тривалості життя і відсутність плато на кривих виживання були у потомків першого покоління від схрещувань Dadxtg4, Dadxtg6 (S75 - 3-4 доби, S50 - 6 діб, та S25 - 8-9 діб, МТЖ - 13-16 діб). Трохи нижчі па­раметри тривалості життя були у особин від схрещувань tkvxtg4, tkvxtg6 (S75 - 2 доби, S50 - 3 доби, та S25 - 7-8 доби, МТЖ - 13-16 діб).

Отже, мутанти за геном дистрофіну характеризувалися швидким відмиранням особин та значно зниженими показниками як СТЖ, так і МТЖ порівняно з лінією дико­го типу Oregon. Додаткова копія генів Dad та tkv не виявила позитивного впливу на три­валість життя мух, мутантних за геном дистрофіну, оскільки виживання особин не збі­льшувалося і показники ТЖ не зростали.

Таблиця 2

Параметри тривалості життя особин першого покоління від схрещувань мутантів за геном дистрофіну з лініями, що містять ген-модифікатор

Лінії

СТЖ, доби

МТЖ (доби), M±m

 

S75, M±m

S50, M±m

S25, M±m

 

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

В Рішко - Вплив генів-модифікаторів dad і tkv на фенотиповий прояв мутацій гена дистрофіну