О М Біловол - Клінічна імунологія та алергологія - страница 8

Страницы:
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  51  52  53  54  55  56  57  58  59  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  71  72  73  74  75  76  77  78  79  80  81  82  83  84  85  86  87 

Визначення гемолітичної активності комплементу. Гемолітична активність комплементу - функціональний показник, який знижується при нестачі хоча б одного з компонентів комплементу. Визначення гемолітичної активності комплементу проводять таким чином. До еритроцитів барана, покритих антитілами, додають досліджувану сироватку (як контроль використовують сироватку здорових осіб). Комплемент, присутній у сироватці, зв' язується зантитілами до нього, утворені імунні комплекси викликають гемоліз еритроцитів. Якщо вміст комплементу в досліджуваній сироватці знижений, вона викличе менш виражене руйнування еритроцитів, ніж нормальна сироватка. Нормальна гемолітична активність комплементу свідчить про те, що у сироватці присутні всі компоненти класичного шляху його активації (C1-C9) у достатній кількості.

Інтенсивність лізису оцінюють спектрофотометричним методом через різні проміжки часу. На основі одержаної кривої визначають час 50% гемолізу (СН50).

Збільшення загальної кількості комплементу відбувається при: обструктивній жовтяниці, тиреоїдиті Хашимото, гострій ревматичній лихоманці, вузликовому поліартеріїті, дерматоміозиті, гострому інфаркті міокарда, виразковому коліті, тифозній лихоманці, цукровому діабеті І типу, синдромі Рейтера, подагрі.

Зменшення загальної кількості комплементу відбувається при: СЧВ з ураженням нирок, гострому гломерулонефриті, сироватковій хворобі, імунокомплексних захворюваннях, цирозі печінки, комбінованих імунодефіцитах, септичному ендокардиті з гломерулонефритом, рецидивуючих ангіоневротичних набряках, пароксизмальній холодовій гемоглобінурії, міастенії Гравіс, вірусному гепатиті з ураженням суглобів, змішаній кріоглобулінемії, лімфомі.

Крім загальної гемолітичної активності комплементу, за допомогою радіальної імунодифузії за Манчіні визначають концентрацію окремих компонентів комплементу (частіше С3 та С4). Визначення C3 і C4 дозволяє встановити переважаючий шлях активації комплементу. C4 витрачається лише при активації за класичним шляхом. C3 бере участь як у класичному, так і в альтернативному шляху активації, проте при активації за альтернативним шляхом рівень C3 знижується значніше.

Кріоглобуліни - це імуноглобуліни сироватки, які оборотно преципітують при температурі нижче 37 °С. Для виявлення кріоглобулінів збирають кров, дають їй скипітися і відбирають сироватку. Всі маніпуляції проводять при кімнатній температурі. Сироватку на ніч поміщають у холодильник (при 4 °C), після чого центрифугують і визначають, яку частину її об' єму займає преципітат. Точніший спосіб заснований на визначенні спектрофотометрії білка у відмитому преципітаті, отриманому з фіксованого об'єму сироватки.

Преципітат, що містить як моноклональні (наприклад, ревматоїдний чинник), так і поліклональні (наприклад IgG) антитіла, називається змішаними кріоглобулінами. Змішана кріоглобулінемія зазвичай виявляється при васкулітах шкіри. При цьому найчастіше вражаються ділянки тіла, схильні до дії холоду. Змішана кріоглобулінемія характерна для автоімунних захворювань. Вона спостерігається при СЧВ, вузликовому періартеріїті, синдромі Шегрена і хворобі Кавасакі. Гепатити A, B і С завжди супроводжуються кріоглобулінемією. Кріоглобуліни виявляються також при гемобластозах, хронічних інфекціях і саркоїдозі. Якщо кріопреципітати містять лише моноклональні антитіла, виключають мієломну хворобу і макроглобулінемію Вальденстрема.

 

Визначення показників фагоцитозу Фагоцитарна активність нейтрофілів звичайно підвищується на початку розвитку запального процесу. Її зниження призводить до хронізації запального процесу та підтримання автоімунного процесу, оскільки при цьому порушується функція руйнування та виведення циркулюючих імунних комплексів з організму.Фагоцитарне число середня кількість мікроорганізмів, поглинутих одним нейтрофілом крові. Характеризує поглинальну здатність нейтрофілів. У нормі складає 5-10 мікробних частин.

Процент фагоцитозу - процент нейтрофілів, що беруть участь у фагоцитозі. В нормі складає 65-95%.

Підвищення показників спостерігається при: антигенному подразненні внаслідок бактеріального запалення (продромальний період, період гострого прояву інфекції) при нормальній активності фагоцитозу; лейкоцитозі; алергічних реакціях; автоімунних захворюваннях; посиленні антитілозалежної цитотоксичності та реакції на донорський трансплантат.

Зниження показників спостерігається при: хронічних запальних захворюваннях бактеріальної та вірусної природи; уроджених дефектах фагоцитарної системи, синдромі Чедіака-Хігасі, хворобі Дауна, СЧВ, колагенозах, хворобі імунних комплексів, дефіциті імуноглобулінів, комплементу; лікуванні цитостатиками, імунодепресантами, опроміненням іонізуючою радіацією; вторинних та первинних імунодефіцитах; новоутвореннях; тяжких опіках, травмах, стресах; кишкових та ниркових синдромах втрати білку; недостатності харчування; недостатності фагоцитозу; хронізації запального процесу.

Спонтанний тест з НСТ (нітросиній тетразолій) дозволяє оцінити ступінь антигенного подразнення не активованих in vitro гранулоцитів крові. Він характеризує ступінь активації внутрішньоклітинних антибактеріальних систем. Принцип методу ґрунтується на відновленні поглинутого фагоцитом розчинного барвника нітросинього тетразолію в нерозчинний діформазан під впливом супероксиданіону, що утворюється в НАДФ-Н-оксидазній реакції, яка ініціює процес стимуляції фагоциту. До фагоцитів додають жовтий фарбник, нітросиній тетразолій, у нормі при його поглинанні метаболічна активність фагоцитів зростає, нітросиній тетразолій відновлюється, продукти цієї реакції забарвлені в синій колір. Про порушення метаболізму фагоцитів судять по зниженню інтенсивності синього фарбування. При виявленні порушень визначають рівень цитохрому Ь558 та інших білків фагоцитів. Показники НСТ-тесту підвищуються в початковому періоді гострих бактеріальних інфекцій, тоді як при хронічному перебігу інфекційного процесу вони знижуються. Санація організму від збудників супроводжується нормалізацією показника. Різке зниження свідчить про декомпенсацію протиінфекційного захисту та є прогностично несприятливою ознакою. Показник спонтанного НСТ-тесту в нормі складає до 10%.

Підвищення показників спостерігається при: антигенному подразненні внаслідок бактеріального запалення (продромальний період, період гострого прояву інфекції) при нормальній активності фагоцитозу; хронічному гранулематозі; лейкоцитозі; алергічних реакціях; автоімунних захворюваннях; посиленні антитілозалежної цитотоксичності.

Зниження показників спостерігається при: хронічних запальних захворюваннях бактеріальної та вірусної природи; уроджених дефектах фагоцитарної системи, синдромі Чедіака-Хігасі; хворобі Дауна, СЧВ, колагенозах, хворобах імунних комплексів, дефіциті імуноглобулінів, комплементу; лікуванні цитостатиками, імунодепресантами, опроміненням іонізуючою радіацією; вторинних та первинних імунодефіцитах; новоутвореннях, тяжких опіках, травмах, стресах; недостатності фагоцитозу; хронізації запального процесу.Індукований НСТ-тест дозволяє оцінити функціональний резерв кисневозалежного механізму бактерицидності фагоцитів. Тест використовують для виявлення резервних можливостей внутрішньоклітинних систем фагоцитів. При збереженій внутрішньоклітинній антибактеріальній активності у фагоцитах різко зростає кількість формазан-позитивних нейтрофілів після їх стимуляції латексом. Зниження показників стимульованого НСТ-тесту нейтрофілів нижче за 20% та моноцитів нижче за 30% свідчить про недостатність фагоцитозу. Величина стимульованого НСТ-тесту в нормі складає 20-40%.

Оцінка фагоцитарної активності лейкоцитів найбільш інформативний спосіб дослідження опсонінів і функціонального стану фагоцитів.

Техніка проведення:

1.   Лейкоцити, виділені з крові хворого, відмивають від сироватки, підраховують і поміщають у середовище, що містить сироватку здорового або хворого (джерело опсонінів) і живі бактерії (зазвичай Staphylococcus aureus або Escherichia coli).

2.   Суміш інкубують при 37 °С, відбираючи проби через 0, 30, 60 і 120 хв після початку інкубації. Для визначення числа життєздатних бактерій кожну пробу швидко охолоджують і роблять посів.

3.   Через 2 год. після початку інкубації суміш центрифугують. Лейкоцити і фагоцитовані бактерії осідають на дно, а нефагоцитовані бактерії залишаються в надосадовій рідині. В осаді і надосадовій рідині визначають число життєздатних бактерій.

Оцінка результатів. У нормі протягом 2 год. фагоцитами поглинається і руйнується близько 95% бактерій. При хронічній гранулематозній хворобі число зруйнованих бактерій не перевищує 10%, а всередині лейкоцитів виявляються життєздатні бактерії. Присутність живих бактерій у лейкоцитах при інкубації з сироваткою здорового свідчить про порушення переварювання бактерій у відсутність зниження здатності до захоплення бактерій. Підвищений вміст життєздатних бактерій у надосадовій рідині при інкубації з сироваткою хворого свідчить про дефіцит опсонінів.

Хемотаксис лейкоцитів. Порушення хемотаксису може бути обумовлене дефектом фагоцитів, наявністю інгібіторів хемотаксису, дефіцитом сироваткових або тканинних чинників хемотаксису.

Метод шкірного вікна. За допомогою скальпеля видаляють поверхневий шар епідермісу площею 4 мм (при цьому повинна з' явитися невелика кількість крові). На пошкоджену ділянку поміщають покривне скло. Протягом доби кожні 0,5-2 год. покривне скло міняють. Потім стекла забарвлюють і досліджують під мікроскопом лейкоцити, що знаходяться на них. У нормі протягом перших 2 год. спостерігається притік нейтрофілів до місця пошкодження. Протягом подальших 12 год. нейтрофіли заміщаються моноцитами.

Дослідження хемотаксису in vitro засноване на стимуляції виділених з крові фагоцитів чинниками хемотаксису. Здібність фагоцитів до направленої міграції можна оцінити, помістивши їх в камеру Бойдена або чашку Петрі з агарозою.

Адгезія лейкоцитів. Порушення адгезії лейкоцитів обумовлене зниженням експресії або відсутністю на їх поверхні молекул адгезії, наприклад CD11/CD18. Для визначення молекул адгезії застосовують проточну цитофлюоріметрію. Відсутність   CD11/CD18   на   нейтрофілах   і   моноцитах   виявляється пізнімвідпаданням пуповини, рецидивуючими бактеріальними інфекціями, пародон-титом. Адгезію лейкоцитів можна також оцінити за їх здатністю прилипати до ендотеліальних клітин.

 

Імунологічні тести, які характеризують клітинний імунітет

(Т-ланка)

 

Т-клітинний імунітет оцінюють за такими показниками:

-   кількість Т-лімфоцитів;

-   визначення субпопуляцій Т-лімфоцитів.

Проточна цитометрія проводиться з використанням моноклональних антитіл, пов' язаних з флюоресцентними фарбниками. Проводять фарбування клітинних елементів крові. Моноклональні антитіла мають ідентичну специфічність до мембранних антигенів, тому вони згруповані і позначені відповідним номером кластера диференціювання (CD). Клітини крові поодинці перетинають сфокусований світловий промінь, зазвичай лазерний. Світло певної довжини порушує молекули флуоресціюючих фарбників, пов'язаних з різними клітинними компонентами, при цьому може відбуватися одночасне збудження декількох різних фарбників, що дозволяє оцінити відразу декілька клітинних параметрів. Світло, що випускається фарбниками, збирають за допомогою системи лінз і дзеркал і розкладають на компоненти. Світлові сигнали детектують, перетворюють в електричні імпульси і далі у форму, зручну для комп' ютерної обробки і зберігання інформації.

Всі Т-лімфоцити мають поверхневий рецептор (кластер диференціювання) CD2, зрілі лімфоцити - CD3, Т-хелпери CD4, Т-супресори/цитотоксичні Т-лімфоцити - CD-8, NK-клітини - CD-16.

Метод розеткоутворення. Тест розеткоутворення з еритроцитами барана (Е-РОК, розеткоутворюючі клітини) застосовують для виявлення Т-лімфоцитів. Показано, що Е-рецептори ідентичні CD2, що виявляються моноклональними антитілами і присутні на Т-клітинах.

Е-РУК тот. - загальна кількість Т-лімфоцитів, що утворили розетки.

Е-РУК акт. - кількість Т-лімфоцитів, що утворили активні розетки. Активні розетки утворюються при певному співвідношенні кількості еритроцитів і лімфоцитів і без інкубації після центрифугування.

Е - РУК + ГТ - кількість Т-лімфоцитів, що утворили гравітаційні розетки. Гравітаційні розетки утворюються при спонтанній седиментації клітин, тобто без центрифугування, протягом 1 год.

Тести навантажень з лікарськими і другими речовинами. Зазвичай застосовують інкубацію клітин протягом певного часу з невеликими дозами, близькими до фізіологічних кількостей препаратів, або без них. Тести ставлять з лікарськими препаратами, зокрема імунокоригуючими (тималін, левомізол і ін.), для того, щоб, визначивши дію препарату на клітини, прогнозувати ефективність його застосування при лікуванні.

У розеткоутворенні найчастіше використовуються наступні тести навантаження:

2)   1) інкубація клітин при 37 оС протягом 0,5-2 год.інкубація клітин протягом того ж часу з розчинами різних препаратів у концентраціях, близьких до фізіологічних, наприклад з левамізалом, теофіліном, Т-активіном, іншими імунокоригуючими препаратами;

3)   інкубація клітин з різними дозами цих же препаратів.

Тест навантаження Е-розеткоутворення з теофіліном є способом оцінки функціональних субпопуляцій лімфоцитів, оскільки інкубація з цим препаратом призводить до зменшення розеткоутворення переважно клітин, що мають супресорну активність, мало впливаючи на клітини з хелперною активністю. Теофілін-резістентні Т-клітини - субпопуляція Т-лімфоцитів, що мають хелперну (CD4) активність, теофілін-чутливі Т-клітини - субпопуляція Т-лімфоцитів, що мають супресорну (CD8) активність.

Нульові клітини (%) визначають по формулі 100 (%) - (Е-РУК + М-РУК).

Реакція бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ). Для стимуляції Т-лімфоцитів in vitro використовують наступні речовини.

1.   Мітогени - фітогемаглютинін, конканавалін A та ін. - викликають неспецифічну (не обумовлену зв' язуванням з антигенрозпізнаючими рецепторами) активацію Т-лімфоцитів.

2.   Розчинні антигени - антигени Candida albicans, правцевий анатоксин -зв'язуючись з антигенрозпізнаючими рецепторами Т-лімфоцитів пам'яті, виклика­ють специфічну активацію цих клітин.

3.   Алогенні клітини (у змішаній культурі лімфоцитів) активують Т-лімфоцити, оскільки несуть на своїй поверхні антигени HLA класу II.

4.   Антитіла до поверхневих антигенів Т-лімфоцитів, що беруть участь у їх

активації, - CD2, CD3, CD43.

5.   Хімічні речовини, наприклад, форболмірістатацетат (активує протеїнкіназу C) та іономіцин (підвищує зміст внутрішньоклітинного кальцію).

Активацію Т-лімфоцитів зазвичай оцінюють за наступними показниками.

1.   Проліферація.

2.   Вироблення цитокінів - интерлейкінів-2 -4, -5, інтерферона у, чинника некрозу пухлин.

3.   Експресія маркерів активації - CD25 і антигенів HLA класу II.

4.   Цитотоксичність.

Під дією мітогенів, антигенів і алогенних клітин Т-лімфоцити, що покояться, активуються, перетворюються на бластні клітини і починають ділитися.

Спонтанна проліферація лімфоцитів (бласттрансформація) буває підвищена у хворих, що перенесли багатократні переливання крові, хворих алергічними і автоімунними захворюваннями, при бактерійних і вірусних інфекціях, а також у новонароджених.

Оцінку клітинного імунітету проводять також за допомогою шкірних проб, заснованих на алергічних реакціях сповільненого типу. Антигени для проведення проб підбирають на підставі даних анамнезу. Позитивна реакція при проведенні шкірних проб дозволяє виключити важку недостатність клітинного імунітету, тоді як негативна реакція не має діагностичного значення. Дози антигенів для проведення шкірних проб наведені у табл. 3.
При проведенні цього дослідження необхідно дотримувати наступних правил.

1.   Слід упевнитися в активності антигена, для чого шкірну пробу потрібно спочатку провести у здорової людини, чутливої до нього.

2.   Слід враховувати, що при проведенні проб на фоні імуносупресивної терапії можливі псевдонегативні результати.

3.   Слід з' ясувати, чи контактував хворий у минулому з антигенами, використовуваними при постановці проб, і якщо так, чи не було при цьому місцевих або системних реакцій. При важких реакціях в анамнезі шкірні проби з даним антигеном не проводять або проводять з менш концентрованим антигеном.

4.   Шкірні проби проводять таким чином.

Для шкірної ін' єкції використовують окремий стерильний туберкуліновий шприц об'ємом 1 мл і голку 27 G завдовжки 13 мм.

У шприц набирають 0,1 мл розчину антигена, видаляють бульбашки повітря.

Антиген вводять внутрішньошкірно в передпліччя або спину.

Відразу після введення антигена в місці ін'єкції повинен з'явитися пухир діаметром 5-10 мм. Якщо пухир не з'явився, ін'єкція зроблена не внутрішньошкірно, а підшкірно. В цьому випадку антиген вводять повторно в іншу ділянку шкіри.

Місце ін' єкції обводять, наприклад, кульковою ручкою.

Результати оцінюють через 24 і 48 год. Якщо через 24 год. результат проби негативний, можна вводити більш концентрований розчин антигену.

Для проведення шкірних проб зазвичай використовується комерційний набір Мультітест CMI, що складається з 7 антигенів: Candida albicans, Trichophyton spp., Proteus spp., правцевого анатоксину, дифтерійного анатоксину, стрептокінази і очищеного туберкуліну. Слід зазначити, що оцінка результатів дослідження із застосуванням цього набору часто буває утруднена, оскільки при позитивній реакції пухир може бути невеликим (трохи більше 2 мм).Імунологічні тести, які характеризують гуморальний імунітет

(В-ланка)

 

Гуморальну ланку імунної системи оцінюють за такими показниками:

-    кількість В-лімфоцитів;

-    кількість сироваткових імуноглобулінів (класів A, M,G, E).

На сьогодні з метою ідентифікації лімфоцитів використовують 3 групи методів: імунофлюоресценція - проточна цитометрія, розеткоутоворення, імуноферментний аналіз.

Метод проточної цитометрії. На клітинній мембрані лімфоцитів знаходиться безліч глікопротеїдів, які можна виявити при проточній цитофлюориметрії за допомогою моноклональних антитіл. Деякі з цих глікопротеїдів специфічні для певного типу клітин, наприклад: Т-, B- і NK-лімфоцитів, різних субпопуляцій Т-лімфоцитів, моноцитів і навіть для певних стадій їх дозрівання і диференціювання. Ці молекули прийнято позначати CD. Визначення В-лімфоцитів за допомогою проточної цитофлюориметрії засноване на виявленні імуноглобулінів, фіксованих на поверхні клітин, CD19 і CD20. При оцінці результатів дослідження необхідно враховувати вік хворого. У дітей старшого віку і дорослих В-лімфоцити складають 10-20% всіх лімфоцитів крові, у дітей молодшого віку їх більше.

Метод розеткоутворення ґрунтується на наявності на мембрані В-лімфоциту рецептора для Fc-фрагменту імуноглобулінів та третього компоненту системи комплементу (С3). Вони здатні утворювати розетки лише з еритроцитами миші, які оброблені антитілами, та в присутності комплементу (ЕМ-РУК). Показано, що ЕМ-рецептори ідентичні тим, що виявляються моноклональними антитілами CD22, і присутні на зрілих B-лімфоцитах. Таким чином, тест розеткоутворення з еритроцитами миші (ЕМ-РУК) використовують для виявлення В-лімфоцитів, що мають рецептори CD22.

Визначення абсолютної кількості В-лімфоцитів. Абсолютна кількість В-лімфоцитів у нормі складає 0,28-0,31-106 /л.

Підвищення абсолютної кількості В-лімфоцитів спостерігається при: гострих бактеріальних, грибкових, паразитарних захворюваннях, СНІДі (початковий період), хронічних захворюваннях печінки (цироз, вірусний гепатит), автоімунних захворюваннях (ревматоїдний артрит, СЧВ, ревматизм, колагенози), саркоїдозі, муковісцидозі, хворобі Крона, хворобі Вальденстрема, моноклональній гаммапатії, інфекційному мононуклеозі, хронічному лімфолейкозі, в гострому періоді повторної інфекції.

Зниження абсолютної кількості В-лімфоцитів спостерігається при: фізіологічній гіпогаммаглобулінемії у дітей (у віці 3-5 міс.), уродженій гіпогаммаглобулінемії або агаммаглобулінемії, новоутвореннях імунної системи, лікуванні цитостатиками й імунодепресантами, станах після видалення селезінки, недостатності гуморальної ланки імунітету.

Визначення IgG, IgA, IgM методом радіальної імунодифузії за Mancini et
al,
оснований на тому, що зразки досліджуваних сироваток поміщують у лунки
агару, який містить антитіла до
Ig одного з класів IgG, ^А,                                    у відомій

концентрації. Імуноглобуліни, дифундуючи з лунок в агар, при взаємодії з відповідними антитілами будуть утворювати кільця преципітації, розмір яких знаходиться в тісній залежності від вмісту в сироватці обстежуваного Ig того чиіншого класу. Рівень сироваткових Ig відображує функціональний стан В-клітинної ланки імунної системи у відповідь на стимуляцію організму антигенними подразниками.

Страницы:
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  51  52  53  54  55  56  57  58  59  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  71  72  73  74  75  76  77  78  79  80  81  82  83  84  85  86  87 


Похожие статьи

О М Біловол - Клінічна імунологія та алергологія

О М Біловол - Основи діагностики, лікування і профілактики основних кардіологічних захворювань