А Бабський, М Клевець, Н Банзал - Вплив гіпертермії на життєздатність клітин фібросаркоми - страница 1

Страницы:
1 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF LVIV UNIV.

Серія біологічна. 2007. Вип. 44. С. 31-36 Biology series. 2007. Is. 44. P. 31-36

УДК 576:577

ВПЛИВ ГІПЕРТЕРМІЇ НА ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ КЛІТИН ФІБРОСАРКОМИ

А. Бабський**, М. Клевець**, Н. Банзал*

Відділ радіології Університету Індіани, Індіанаполіс 950 West Walnut, R2, E124, Indianapolis, IN 46202, USA Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського, 4, Львів 79004, Україна e-mail: ababsky@iupui.edu

Інкубація ізольованих клітин радіаційно-індукованої фібросаркоми протягом 30 хв за температури 45оС призводила до достовірного зниження життєздатності клітин, яке оцінювали за співвідношенням живих і відмер­лих клітин, а також за здатністю клітин утворювати колонії. Інгібітор Na+/ Н+-обмінника 5-(№етил^-ізопропіл)амілорид (3 мкМ) суттєво не впливав на термочутливість клітин. Na-іонофор монензин (2 мкМ) достовірно збіль­шував кількість відмерлих клітин відразу після гіпертермії і у 50-55 разів зменшував здатність клітин утворювати колонії. Зниження життєздатності клітин після гіпертермії пов'язане зі структурними перебудовами плазмати­чної мембрани, збільшенням її проникності та втратою здатності підтриму­вати іонні градієнти.

Ключові слова: фібросаркома, гіпертермія, натрій, амілорид, монензин.

Гіпертермію (41-46oC) здавна використовують для лікування ракових пухлин [8, 10]. Клінічні результати свідчать про суттєве підвищення ефективності променевої тера­пії, хіміотерапії, фотодинамічної терапії та протиракових вакцин на фоні гіпертермії [12, 19, 22]. Проте високі температури можуть і безпосередньо впливати на ракові клітини. Однак механізми цього впливу ще не є повністю зрозумілими. Існує гіпотеза, що плазма­тична мембрана слугує важливою мішенню за гіпертермійного впливу на клітину [7, 17].

Одним із найважливіших показників стабільності плазматичної мембрани є граді­єнт іонів Na+. Він відіграє провідну роль при виживанні клітин оскільки причетний до гомеостазу клітинного об'єму, формування мембранного потенціалу та градієнта інших іонів, поглинання і вивільнення клітинних метаболітів, активності внутрішньоклітинних та мембрано-зв'язаних ферментів, регулювання клітинної енергетики та синтезу білків [6, 13]. Швидкі зміни внутрішньоклітинної концентрації Na+ (|Т\Га+]в) спостерігаються за сти­муляції росту клітин факторами росту [11] та протягом клітинного циклу у багатьох клі­тинних лініях [1]. Більшість живих клітин підтримують низьке значення [№+]в (5-15 мМ) на противагу високому значенню у міжклітинному просторі (~145 мМ).

Показано, що ріст ракових пухлин супроводжується зростанням [№]в [4]. Це в основному пов'язано зі зниженням функціональної активності №/К+-АТФази внаслідок гіпоксійного стану пухлини і зсуву енергетичного обміну від окисного фосфорилювання до гліколізу. При цьому спостерігається закислення внутрішньоклітинного середовища. За цих умов традиційно зростає активність №/Н+-антипортера, який транспортує протон назовні, а Na+ відповідно усередину клітини, збільшуючи [№]в. Для вивчення ролі цього обмінника використовують інгібіторний аналіз за допомогою амілоридів. 5-(№етил-№ ізопропіл)-амілорид (ЕІПА) є найбільш специфічним і ефективним серед них [15]. З ін­шого боку, для моделювання посилення входу Na+ у клітину використовують метаболіт Streptomyces cinnamonensis монензин, який є моновалентним №+-іонофором і регулює активність Na+ЛгҐ-обмінника [23].

© Бабський А., Клевець М., Банзал Н., 2007

Метою цієї роботи було вивчення впливу нормальної (37оС) та високої температу­ри (45оС) на життєздатність клітин радіаційно-індукованої фібросаркоми (RIF-1) та їх здатність утворювати колонії, а також вплив ЕІПА та монензину на ці процеси.

Клітини RIF-1 вирощували у культуральному середовищі Веймос (Sigma, St. Louis, USA), до якого додавали 10%-ний бичачий сироватковий альбумін, 10 мM 4-2 (гідроксиетил)-1-піперазинетансульфонову кислоту (HEPES), 27 мМ NaHCO3 і 1%-ний стрептоміцин і пеніцилін; підтримували атмосферу 5% СО2 при 37оС. RIF-1 клітини на стадії експоненціального росту культивували на стінці пластикових контейнерів (об'єм 150 см3). Клітини змивали зі стінок 0,05%-ним трипсином, осаджували центрифугуван­ням (1000 хв-1, 10 хв), а осад суспендували у фосфатному буфері.

Для оцінки життєздатності RIF-1 клітини поміщали у пробірки з буфером Генкса (GibcoBRL, Grand Island, NY) по 6-7><106 клітин в 1 мл. Одну групу клітин інкубували 30 хв при 37оС, а іншу - такий самий час при 45оС. Кожна група була поділена на три підгрупи: 1) за присутності 3 мкМ ЕІПА, 2) за присутності 2 мкМ монензину, 3) без ЕІПА і монензину (контроль). Для кожної підгрупи використовували три різні варіанти кілько­сті клітин. Після інкубування клітини відмивали від ЕІПА чи монензину буфером Генкса. Для оцінки життєздатності з кожної пробірки відбирали пробу об'ємом 25 мкл, яку фар­бували 1%-ним фіолетовим барвником для підрахунку кількості клітин у гемоцитометрі (камері Горяєва). Для оцінки здатності утворювати колонії решту клітин поміщали у сте­рильні чашки Петрі із 5 мл Waymouth середовища та культивували в інкубаторі при 37оС в атмосфері 95% О2 та 5% СО2. Через 7-9 днів колонії, що утворились навколо кожної клітини, фіксували 1%-ним фіолетовим барвником (Crystal violet, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) для подальшого підрахунку. Ефективність утворення колоній вираховували по співвідношенню кількості утворених колоній до кількості висіяних клітин. Кожен екс­перимент було повторено чотири рази. Результати наводимо у вигляді M±m. Статистич­ний аналіз даних проводили за критерієм Стьюдента з використанням програми Statistica (версія 5.1). Статистично достовірними вважали відмінності із Р<0,05.

Порівняння кількості клітин відразу після їх інкубування при 37оС та 45оС показа­ло, що гіпертермія ймовірно (Р<0,05) збільшувала співвідношення кількості нежиттєздат­них до життєздатних клітин на 90% (рис. 1, А). Для з'ясування можливої ролі іонів Na+ при дії високих температур до суспензії клітин додавали інгібітор Na+ЯҐ-обмінника ЕІ-ПА та №+-іонофор монензин. Присутність ЕІПА і монензину не впливала на співвідно­шення кількості нежиттєздатних до життєздатних клітин після інкубування при 37оС. Проте при 45оС монензин збільшував ефект гіпертермії більш, ніж у три рази (Р<0,05), в той час як ЕІПА при цій температурі не виявляв вираженого зростання співвідношення порівняно з дією тільки гіпертермії (рис. 1, А).

Підрахунок кількості колоній, які утворилися за 7-9 днів після висівання клітин, суспендованих при 37оС та 45оС, показав, що гіпертермія ймовірно зменшує співвідно­шення кількості колоній до кількості висіяних клітин із 0,29±0,01 (після 37oC) до 0,057±0,008 (після 45oC) (p<0,01) (рис. 1, Б). Інгібування Na+ЛН+обмінника за допомогою ЕІПА суттєво не впливало на утворення колоній клітин і після нормотермії (37оС), і після гіпертермії (45оС). Монензин, не впливаючи на процеси утворення колоній після інкубу­вання клітин при 37оС, суттєво пригнічував цей процес на фоні гіпертермії. Співвідно­шення кількості колоній до кількості висіяних клітин при цьому було у 50-55 разів ниж­чим (Р<0,0001) порівняно з лише гіпертермією (рис. 1 і 2). Таким чином, монензин, на відміну від ЕІПА, суттєво збільшував термочутливість клітин фібросаркоми.

Одним із можливих механізмів безпосередньої дії гіпертермії на рако­ві клітини є структурні перетворення у плазматичній мембрані. L. Anghileri [2] стверджує, що гіпертермія змінює проникність клітинної мембрани за рахунок збільшення фізичної розрі­дженості мембранних ліпідів, що ціл­ком може супроводжуватися дифузією іонів Na+3a концентраційним градієн­том і зростанням [Na]+B. Зміна струк­турованості мембрани може також впливати на кінетику роботи мембрано -зв'язаних протеїнів, зокрема Na+/K+-АТФази та переносників інших іонів.

Наші попередні результати на суперфузованих RIF-1 клітинах пока­зали, що нагрівання клітин до 45°С протягом ЗО хв призводило до зростан­ня рівня [Na+]B на —50%, зменшення рНв на 0,42 одиниці і зниження спів­відношення АТФ/ФН на 40-45% [3]. Протягом післягіпертермійної супер-фузії клітин при 37°С значення рНв та АТФ/ФН поверталися до норми, a [Na^ спочатку знижувався, щоб згодом зно­ву зрости до гіпертермійного рівня

0.001

ня.

чий [№+]в ефект температури достові­рно зменшувався, підтверджуючи, що

через 60 хв після закінчення нагрівай- „    , 0 ... ^тт-г.

ґ ґ        Рис. 1. Вплив гіпертермії, ЕІ1ІА та монензину на вижи-

За присутності ЕІПА стимулюю- вання клітин RIF-1 (А) і їх здатність утворювати

колонії (Б). Достовірні зміни: а - Р<0,05 (45оС

vs. 37оС), б - Р<0,05 (45оС: монензин vs. ЕІПА

. . чи контролю).

цей ефект реалізується в основному

через активацію Na+/H+- обмінника. Однак ЕІПА не призводив до подальшого закислення внутрішньоклітинного середовища. За блокади Na+ЛҐ-обмінника гомеостаз рНв може підтримуватися такими транспортними системами, як НСОз7СГ-обмінник [16] чи симпо-ртер монокарбоксильних кислот [5]. Цим, очевидно, можна було б пояснити відсутність достовірного впливу ЕІПА на термочутливість клітин, оскільки роль низьких значень рНв у відмиранні ракових клітин зазначалася раніше [16].

Однак підвищення [№+]в може впливати на термочутливість ракових клітин навіть без виражених змін рНв чи біоенергетичного статусу. №+-іонофор монензин суттєво при­скорював відмирання ракових клітин за умов гіпертермії, як свідчать результати, пред­ставлені на рис. 1 і 2. За умов структурних перетворень плазматичної мембрани, виклика­них високими температурами, зростає можливість для монензину у комплексі з іоном Na+ проникати крізь мембрану [18]. З ішого боку, за умов гіпертермії цей №+-іонофор, сти­мулюючи вхід іонів Na+ у клітину, може викликати незворотне зменшення трансмемб­ранного градієнта. За цих умов можливе токсичне нагромадження Са[1]+ після гіпертермії,

Контроль ЕІПА Монензин

37оС, 30 хв

45оС, 30 хв

Рис. 2. Вплив гіпертермії, ЕІПА та монензину на здатність клітин RIF-1 утворювати колонії. Представлено фото RIF-1 колоній репрезентативного експерименту.

яке було продемонстровано на людських епідермальних клітинах А431 [14] і асцитних клітинах карциноми Ерліха [2]. Відомо, що монензин також суттєво підвищує ефектив­ність клітинних токсинів рицину [9] та адріаміцину [20] за їх дії на ракові клітини. Цей іонофор також викликає некроз клітин скелетних м'язів і міокарда [21]. Наші попередні дані показали, що суперфузія RIF-1 клітин із монензином протягом 40-50 хв навіть при 37оС викликала зростання [№+]в на 50%, яке з часом навіть збільшувалось. При цьому сам монензин практично не впливав на рівень рНв і співвідношення АТФ/Фн. Таким чи­ном, наші та літературні дані вказують на можливість збільшення термочутливості рако­вих клітин без достовірного закислення клітин.

Автори вдячні Давиду С. Нельсону (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA) за допомогу при плануванні та проведенні експериментів.

1. Abdul M., Hoosein N. Voltage-gated sodium ion channels in prostate cancer: expression and activity // Anticancer Res. 2002. Vol. 22. P. 1727-1730.

3. Babsky A., Hekmatyar S. K., Gorski T. et all. Heat-induced changes in intracellular so­dium, pH and bioenergetic status in RIF-1 tumor cells determined by 23Na and 31P mag­netic resonance spectroscopy // Intern. J. Hyperthermia. 2005. Vol. 21. N 2. P. 141-158.

4. Babsky A., Hekmatyar S. K., Zhang H. et all. Predicting and monitoring response to che­motherapy by 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea in subcutaneously implanted 9L glioma using apparent diffusion coefficient of water and 23Na Magnetic Resonance Imaging // J. Magn. Res. Imaging. 2006. Vol. 24. P. 132-139.

5. Barbarat B., Podevin R. A. Stoichiometry of the renal sodium-L-lactate cotransporter // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. N 25. P. 12190-12193.

6. Cevc G. Membrane electrostatics // Biochim. Biophys. Acta. 1990. Vol. 1031. P. 311-382.

7. Gonzalez-Mendez R., Minton K. W., Hahn G. M. Lack of correlation between membrane lipid composition and thermotolerance in Chinese hamster ovary cells // Biochim. Bio-phys. Acta. 1982. Vol. 692. P. 168-170.

8. Dewhirst M. W., Prosnitz L, Thrall D. et all. Hyperthermic treatment of malignant diseases: current status and a view toward the future // Semin. Oncol. 1997. Vol. 24. P. 616-625.

9. Dosio F., Franceschi A., Ceruti M. еt all. Enhancement of ricin toxin A chain immu-notoxin activity: synthesis, ionophoretic ability, and in vitro activity of monensin deriva­tives // Biochem. Pharmacol. 1996. Vol. 12. N 1. P. 157-166.

10. FalkM. H., IsselsR. D. Hyperthermia in oncology // Int. J. Hyperthermia 2001. Vol. 17. P. 1-18.

11. Karlsen T. V, Serck-Hanssen G. Acute stimulation by IGF-I of amino acid transport sys­tem A in chromaffin cells depends on PI3 kinase activation and the electrochemical gra­dient of Na+ // Ann. NY Acad. Sci. 2002. Vol. 971. P. 573-575.

12. Kelleher D. K., Thews O., Scherz A. еt all. Combined hyperthermia and chlorophyll-based photodynamic therapy: tumour growth and metabolic microenvironment // Br. J.

Cancer. 2003. Vol. 89. P. 2333-2339.

13. Kelly J. M., McBride B. W. The sodium pump and other mechanisms of thermogenesis in selected tissues // Proc. Nutr. Soc. 1990. Vol. 49. P. 185-202.

14. Kiang J. G., Koeing M. L., Smallridge R. C. Heat shock increases cytosolic free Ca2+ concentration via Na+/Ca2+ exchange in human epidermoid A 431 cells // Am. J. Physiol. 1992. Vol. 263 (Cell Physiol 32). P. C30-C38.

15. Kleyman T. R, Cragoe E. J. Jr. Amiloride and its analogs as tools in the study of ion transport // J. Membr. Biol. 1988. Vol. 105. N 1. P. 1-21.

16. Lyons J. C., Song C. W. Killing of hypoxic cells by lowering the intracellular pH in com­bination with hyperthermia // Radiation Res. 1995. Vol. 141. P. 216-218.

17. Mikkelsen R. B., Asher C. R. Effects of hyperthermia on the membrane potential and Na+ transport of V79 fibroblasts // J. Cell. Physiology. 1990. Vol. 144. P. 216-221.

18. Molenhauer H. H., Morre D. J., Rowe L. D. Alteration of intracellular traffic by monen-sin: mechanism, specificity and relationship to toxicity // Biochim. Biophys. Acta. 1990. Vol. 1031. P. 225-246.

19. Nakayama J., Terao H., Koga T., Furue M. Induction of CD54 and CD58 expression in cultured human endothelial cells by beta-interferon with or without hyperthermia in vi­tro // J. Dermatol. Sci. 2001. Vol. 26. P. 19-24.

20. Schindler M., Grabski S., Hoff E., Simon S. M. Defective pH regulation of acidic com­partments in human breast cancer cells (MCF-7) is normalized in adriamycin-resistant cells (MCF-7adr) // Biochemistry. 1996. Vol. 35. N 9. P. 2811-2817.

21. Shier W. T., DuBourdieu D. J. Sodium- and calcium-dependent steps in the mechanism of neonatal rat cardiac myocyte killing by ionophores. I. The sodium-carrying ionophore, monensin // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1992. Vol. 116. N 1. P. 38-46.

22. Sutton S. W., Yancey L. W., Chase V. A. et all. Intraoperative modality of treatment for peritoneal carcinomatosis: use of hyperthermic interperitoneal chemoperfusion // Perfu-sion. 2002. Vol. 17. P. 441-446.

23. Westley J. W. Polyether antibiotics - naturally occurring acid ionophores. New York: Marcel Dekker, 1982. Vol. 1. P. 1-20.

EFFECT OF HYPERTHERMIA ON VIABILITY OF FIBROSARCOMA CELLS

А. Babsky*'", М. Klevets**, N. Bansal*

Department of Radiology, Indiana University, Indianapolis 950 West Walnut, R2, E124, Indianapolis IN 46202, USA Ivan Franko National University of Lviv 4, Hrushevskyi St., Lviv 79005, Ukraine e-mail: ababsky@iupui.edu

Hyperthermia of radiation-induced fibrosarcoma (RIF-1) cells at 45oC for 30 min caused a significant decrease in cell viability and plating efficiency. 5-(N-ethyl-N-isopropyl)amiloride, an inhibitor of Na+/H+ exchanger, did not significantly change the thermo-sensitivity of RIF-1 cells. In the presence of monensin, Na+ ionophor, the cell viability decreased by 3 times and the plating efficiency decreased by 50-55 times. The hyperthermia-induced decrease in cell viability was linked to an increase in intracellular [Na+] and may be related to the increase in plasma membrane permeability and decrease of transmembrane ion gradient.

Key words: RIF-1, hyperthermia, sodium, amiloride, monensin.

Стаття надійшла до редколегії 15.12.06 Прийнята до друку 22.01.07


[1]Anghileri L .J. Role of tumor cell membrane in hyperthermia // Hyperthermia in cancer treatment (eds. L.J. Anghileri and J. Robert). Boca Raton (Florida, USA): CRC Press Inc., 1985. Vol. 1. P. 1-36

Страницы:
1 


Похожие статьи

А Бабський, М Клевець, Н Банзал - Вплив гіпертермії на життєздатність клітин фібросаркоми