І В Кушкевич, С О Гнатуш - Вплив деяких важких металів на фотосинтезувальні сіркобактерії lamprocystis sp - страница 1

Страницы:
1  2 

УДК 579.26:579.811.26:546.3

ВПЛИВ ДЕЯКИХ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ НА ФОТОСИНТЕЗУВАЛЬНІ СІРКОБАКТЕРІЇ LAMPROCYSTIS SP.

І. В. Кушкевич, С. О. Гнатуш, С. П. Гудзь

Львівський національний університет імені Івана Франка, вул. Грушевського, 4, 79005 Львів, Україна e-mail: lvan_Kushkevych@ukr.net

Вивчено ріст фототрофних сіркобактерій Lamprocystis sp. за впливу CdS04, ZnS04, Pb(N03)2 та CuS04 у концентраціях 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 та 2,5 мМ (у перера­хунку на концентрацію металу). У контрольне середовище не вносили солі мета­лу. Показано, що найсильніше пригнічувало ріст внесення у середовище CuS04, дещо менший вплив виявляв Pb(N03)2. Ці солі в концентрації 0,5 мМ і вище змен­шували нагромадження біомаси на 85 і 59%, відповідно. Внесення CdS04 чи ZnS04 призводило до зниження біомаси лише при високих концентраціях солей у середовищі.

Визначено якісний і кількісний склад основних фотосинтезувальних пігментів у клітинах за цих умов. Внесення солей важких металів у середовище культивуван­ня бактерій Lamprocystis sp. зменшує вміст пігментів у клітинах, що викликає при­гнічення ростових процесів культури.

Ключові слова:   Кадмій, Цинк, Плюмбум, Купрум, сіркобактерії, бактеріохло­рофіли, каротиноїди.

Важкі метали є небезпечними забруднювачами довкілля. Потрапляючи у ґрунт із газопиловими викидами промислових підприємств, автотранспорту, з домішка­ми добрив, пестицидів, вони нагромаджуються в ньому до небезпечних концентра­цій і негативно впливають на ґрунтову біоту, рослини, тварини. По трофічних лан­цюгах іони важких металів можуть потрапляти в організм людини і завдати шкоди її здоров'ю [2].

Тривале застосування для зрошення забрудненої стічної води або мінераль­них, органічних добрив і пестицидів, що мають у своєму складі домішки важких ме­талів, призводить до нагромадження останніх на сільськогосподарських угіддях. Високий їх вміст негативно впливає на ґрунтову мікрофлору [3]. У забруднених іо­нами металів ґрунтах відзначають зниження інтенсивності основних мікробіологіч­них процесів, зокрема процесів трансформаціїорганічних і неорганічних сполук.

І. В. Кушкевич, С. О. Гнатуш, С. П. Гудзь

Для реабілітаціїзабруднених ґрунтів застосовують різні меліоранти, які здатні зменшувати рухливість і токсичність сполук важких металів. Як меліоранти часто використовують різні сорбенти й органічні добрива, котрі закріплюють солі важких металів в органо-мінеральних комплексах [11].

Джерелом забруднення водойм є стічні води заводів, які містять розчини спо­лук важких металів. Це призводить до погіршення якості води та робить неможли­вим перебування в ній водних гідробіонтів [2].

Солі важких металів у природних водах перебувають у розчиненому й адсор­бованому стані, що визначається хімічним складом води, температурою та значен­нями рН. Потрапляючи у воду в іонній формі, вони нагромаджуються в осаді у ви­гляді гідрооксидів, карбонатів, сульфідів або фосфатів. Вміст сполук різних мета­лів у водоймах коливається у широкомудіапазоні значень [12].

Відомо, що мікроорганізми чутливо реагують на зміни факторів навколишнього середовища. У ґрунтах і водоймах, забруднених важкими металами, пригнічується розвиток окремих груп мікроорганізмів, їхня біохімічна активність, змінюється склад мікробних угруповань [3]. Мікроорганізми по-різному реагують на вміст важких мета­лів у середовищі. Одні з них здатні активно транспортувати метали в клітину, інші оса­джують їх на поверхні клітини у вигляді нерозчинних сполук [6]. За токсичністю важкі метали розміщуються у такій послідовності: ртуть, срібло, мідь, кадмій, цинк, сви­нець, хром, нікель, кобальт [1]. Але цей порядок змінюється залежно від виду мік­роорганізму і від форми, у якій цей метал присутній у середовищі [11]. Недисоційова-ні солі й іони, які утворюють комплекси, зазвичай менш токсичні, ніж іони металів. Є дані про вплив важких металів на ціанобактерії, які здійснюють оксигенний фото­синтез [9]. Однак у літературі відсутні дані про вплив важких металів на велику групу мікроорганізмів, здатних здійснювати аноксигенний фотосинтез, - пурпурові сіркобак­терії. Пурпурові сіркобактерії виділяють із водойм, збагачених сірководнем [5]. У ґрун-тахїх мало, але кількість різко збільшується при затопленнях. Зроблено перші кроки до практичного використання фототрофних бактерій для очищення стічних вод.

Метою роботи було вивчення росту, якісного та кількісного складу пігментів фототрофних сіркових бактерій Lamprocystis sp. за впливу солей важких металів.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У роботі використовували фотосинтезувальні сіркобактерії Lamprocystis sp., виділені з водойм Яворівського сіркового родовища.

Бактерії вирощували у рідкому середовищі Ван Ніля такого складу (г/л): амо­ній хлорид - 1; магній хлорид - 0,5; калій дигідрофосфат - 1; натрій хлорид - 1; на­трій гідрокарбонат - 5; натрій судьфід наногідрат - 1; вода дистильована - 1 л, мі­кроелементи. Середовище стерилізували в автоклаві при 1 атм.

10%-ні розчини натрій гідрокарбонату та натрій судьфід наногідрату стерилізу­вали окремо і вносили у середовище перед засівом культур бактерій. рН середо­вища доводили 10%-м розчином фосфатної кислоти до 7,5. Після цього стерильно вносили розчин вітаміну В12 (5 мкг/л).

Для нагромадження біомаси бактерії Lamprocystis sp. культивували протягом 10 діб за анаеробних умов при температурі +25°С і постійному освітленні лампою розжарювання з використанням червоного світлофільтра. Анаеробних умов дося­гали, заповнюючи пробірки місткістю 20 мл середовищем так, щоб під гумовим корком не залишалося повітря.

У середовище вносили солі металів: CdS04, ZnS04, Pb(N03)2 та CuS04 у кон­центраціях 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 та 2,5 мМ (у перерахунку на концентрацію металу). У контрольне середовище не вносили солі металу.

Біомасу культури визначали турбідометрично, використовуючи КФК-3 =660 нм, оптичний шлях 3 мм), на першу, другу, третю, четверту, шосту, восьму та десяту доби росту.

Для визначення якісного та кількісного складу фотосинтезувальних пігментів висушені клітини бактерій руйнували розтиранням із кварцовим піском [8]. Для цього суспензію Lamprocystis sp. центрифугували протягом 45 хв при 8000 об/хв. Надосадову рідину зливали, а одержану біомасу наносили на поверхню скла і ви­сушували при температурі +40°С [10].

Пігменти екстрагували сумішшю етанолу й ацетону (1:1) з висушеної біомаси до повного знебарвлення осаду. Одержані екстракти використовували для реє-страціїспектрів поглинання [8, 14, 15].

Хроматографічне розділення пігментів проводили на силуфолових пластин­ках („Sorbfil", Росія) у висхідному потоці розчинника бензин:ацетон:петролейний ефір:гексан (10:10:3:10). Стандартними зразками (свідками) були астаксантин із панцира креветок та р-каротин із клітин гриба Blakeslea trispora.

Ідентифікацію пігментів проводили за забарвленням на хроматограмах, вели­чинами Rf та максимумами поглинання при різних довжинах хвиль [16].

Спектри поглинання екстрагованих пігментів реєстрували на двопроменевому спектрофотометрі „Specord М-40". Вміст пігментів розраховували на 1 г сухої маси за формулою:

A    H

де А - кількість пігменту, мг/г, С - концентрація пігменту, г/л; V-об'єм екстракту, мл; H- наважка клітин, г; K- відношення об'єму елюату до об'єму розчину, нанесеного на хроматограму.

Концентрацію пігментів розраховували за формулою:

А=^-А E-Г

де D-оптична густина розчину, E-питомий коефіцієнт екстинкції пігменту, лхг1хсм-1; /-товщина поглинаючого шару, см.

Статистичні показники вираховували із експериментальних даних. Для оцінки достовірності різниці між статистичними параметрами альтернативних сукупнос­тей даних обчислювали коефіцієнт Стьюдента [7]. Достовірною вважалася різниця при Р>0,95. Статистичне опрацювання результатів проводили, використовуючи програму 0rigin.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ І ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

Виділена з водойм Яворівського сіркового родовища культура при мікроскопу­ванні мала розміри клітин від 3 до 3,5 мкм. Клітини бактерій були сферичними, ко-коподібними, овальними, містили газові вакуолі. Рухомі. Колір колоній при рості на агаризованому середовищі Ван Ніля від рожевого до фіолетового, клітини утворю­ють несиметричні скупчення. Найінтенсивніший ріст спостерігали при температурі 26°С. Перед поділом клітини набували диплококоподібної форми. Розмножува­лись бактерії бінарним поділом. За Грамом фарбувалися негативно. Культура іден­тифікована як Lamprocystis sp. [4, 13].

Бактерії вирощували протягом 10 діб у середовищі Ван Ніля, в яке вносили кадмій сульфат, цинк сульфат, плюмбум нітрат або купрум сульфат у різних кон­центраціях.

Як видно з рис. 1, при вирощуванні культури Lamprocystis sp. у середовищі Ван Ніля без солей важких металів біомаса була максимальною. Вона зростала до шостої - восьмої доби.

Криві, що відображають ріст бактерій за досліджуваних концентрацій кадмій сульфату (рис. 1, а), схожі в часі з контрольним варіантом, проте біомаса була мен­шою в кожній точці, коли проводилося вимірювання. Так, за концентрації 1,5 мМ бі­омаса зменшилася на 24% на восьму добу порівняно з контролем. Кадмій сульфат концентрацією 2,5 мМ спричинив суттєве інгібування росту. Біомаса Lamprocystis sp. зменшилася на 64% на восьму добу порівняно з контролем.

Цинк сульфат у концентрації 0,5 мМ спричинив незначне зменшення біомаси на шосту добу росту, хоча спостерігали уповільнення ростових процесів до четвер-

2 4 6 8 10 Тривалість культивування, доби

0      2      4      6      8 10 Тривалість культивування, доби

аб

2 4 6 8 10 Тривалість культивування, доби

Тривалість культивування, доби

вг

Рис. 1.    Ріст культури Lamprocystis sp. у середовищі Ван Ніля за різних концентрацій солей важких металів: a - CdS04; 6-ZnS04; в - Pb(N03)2; г - CuS04

Контроль; -•- - 0,5 мМ; 1,0 мМ; -Т-- 1,5 мМ; -»--2,0 мМ; --4--2,5 мМ

Fig. 1.    Grows of Lamprocystis sp. culture in Van Niel medium at different heavy metals salts concentrations: a - CdS04; б - ZnS04; в - Pb(N03)2; г - CuS04

-■- - Control; -•- - 0,5 mM; -A- - 1,0 mM; -У- - 1,5 mM; -♦- - 2,0 mM; --4- - 2,5 mM

Біологічні Студії / Studia Biologica • 2009 • Том 3/№2 C. 71-80тої доби. Збільшення солі металу в середовищі до 1 мМ спричинило призупинен­ня росту від третьої до шостої доби, після чого ріст відновився до восьмої доби. За наявності 1,5 і 2,0 мМ ZnS04 в середовищі ріст культури спостерігали лише до тре-тьоїдоби, після чого він уповільнювався (рис. 1, б).

Плюмбум нітрат у концентрації 0,5 мМ пригнічував нагромадження біомаси на 59% на десяту добу, порівняно з контролем. При збільшенні концентрації металу до 2,0 і 2,5 мМ росту не спостерігали (рис. 1, в).

Купрум сульфат у концентрації 0,5 мМ спричиняв пригнічення процесу нагро­мадження біомаси на 85% порівняно з контролем на десяту добу. За вищих кон­центрацій ріст культури не спостерігали (рис. 1, з).

Порівнявши графіки кривих росту бактерій Lamprocystis sp., можна зробити висновок, що солі важких металів негативно впливають на ріст культури. Купрум сульфат і плюмбум нітрат значно пригнічують ріст бактерій у досліджуваних кон­центраціях упродовж культивування. Кадмій сульфат меншою мірою призводить до інгібування росту сіркобактерій. Цинк сульфат чинить менший інгібуючий вплив на ріст досліджуваних бактерій. Однак, за впливу 0,5-1,5 мМ цієї солі спостерігали уповільнення ростових процесів протягом 2-3 доби, після чого ріст відновлювався.

Таким чином, для бактерій Lamprocystis sp. найсильніше пригнічувало ріст внесення у середовище CuS04, дещо менший вплив виявляв Pb(N03)2. Ці солі в концентрації 0,5 мМ і вище знижували нагромадження біомаси на 85 і 59%, відпо­відно. Внесення CdS04 чи ZnS04 призводило до зниження нагромадження біомаси лише при високих концентраціях солей у середовищі.

Основними пігментами пурпурових бактерій Lamprocystis sp. є бактеріохлорофі­ли та каротиноїди, склад і співвідношення яких визначають забарвлення бактерій [3].

Досліджували якісний і кількісний склад фотосинтезувальних пігментів бакте­рій Lamprocystis sp. за впливу різних концентрацій солей важких металів, зокрема, кадмію, цинку, плюмбуму та купруму.

На основі результатів хроматографічного розділення та спектрального аналізу екстрактів клітин проведено ідентифікацію пігментів бактерій Lamprocystis sp. (див. табл.).

Таблиця

Хроматографічна характеристика пігментного складу бактерій Lamprocystis sp. Chromatographic characteristics of Lamprocystis sp. pigments composition

Назва пігменту

Колір пігменту

Спектри поглинання, X, нм

Значення Rf

Бактеріохлорофіл а

Яскраво-зелений

391,530, 697, 773

0,19

Спірилоксантин

Рожевий

471-483

0,42

Лікопін

Жовтий

434-504

0,55

Родопін

Яскраво-пурпуровий

587

0,83

У розчині екстрагованих пігментів основні максимуми поглинання спостерігали при 391, 471-483, 434-504, 530, 587, 697, 773 нм (рис. 2-4). Досліджувані бактерії містять каротиноїди спірилоксантинового ряду, зокрема спірилоксантин, лікопін і родопін, а також бактеріохлорофіл а.

I. В. Кушкевич, С. О. Гчатуш, С. П. Гудзь

Внесення CdS04, ZnS04, CuS04 не спричиняло змін якісного складу пігментів. Внесення Pb(N03)2 в концентрації 2,5 мМ призводило до зсуву піку з 530 нм у дов­гохвильову ділянку спектра та до його відсутності в ділянці 697 нм.

АЕу

350 391     400 434     471 483 504      530 587       697 773       850 X, нм

Рис. 2.    Спектри поглинання пігментів Lamprocystis sp., вирощених за різних концентрацій CdS04 Fig. 2.    Absorption spectra of pigments of Lamprocystis sp. grown at different CdS04 concentrations

АЕу

1 - Контроль

2- 0,5 мМ

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

І В Кушкевич, С О Гнатуш - Вплив деяких важких металів на фотосинтезувальні сіркобактерії lamprocystis sp