М В Целевич - Вплив катіонів двовалентних металівна базальну мд2+-атф-азну активність плазматичних мембран зародків в'юна - страница 1

Страницы:
1  2  3 

УДК 577.152.3+597.551.2-131

ВПЛИВ КАТІОНІВ ДВОВАЛЕНТНИХ МЕТАЛІВ

НА БАЗАЛЬНУ Мд2+-АТФ-азну АКТИВНІСТЬ ПЛАЗМАТИЧНИХ МЕМБРАН ЗАРОДКІВ В'ЮНА (Misgurnus fossilis L.)

М. В. Целевич

Львівський національний університет імені Івана Франка вуя. Грушевського, 4, Львів 79005, Україна e-mail: mcelevych@yahoo.com

Одержано функціональне підтвердження наявності базальної Са2+-незалеж-ної, Мд2+-залежної АТФ-ази у зародкових клітинах в'юна Misgurnus fossilis L. На ранніх стадіях розвитку зародків виявлено періодичні зміни активності уабаїн-резистентної базальної Мд2+-АТФ-ази за нормальних умов розвитку. Досліджено вплив таких катіонів двовалентних металів, як Cd2+, Zn2+, Mn2+ на активність Mg2+-АТФ-ази бластомерів протягом раннього ембріогенезу. Визначення констант напівінгібування І50 дало змогу проаналізувати чутливість досліджуваної АТФ-ази зародків до впливу катіонів двовалентних металів протягом синхронних поділів бластомерів. Встановлено, що найбільш виражений інгібувальний вплив на Мд2+-АТФ-азну активність здійснює Cd2+, менш виражений - Zn2+, і найнижча інакти-вуюча дія характерна для Mn2+.

Ключові слова: базальна Са2+-незалежна, Мд2+-залежна АТФ-аза, зародки в'юна, плазматична мембрана, Cd2+, Mn2+, Zn2+, поділ бласто­мерів.

THE INFLUENCE OF BIVALENT CATIONS ON THE BASAL PLASMATIC MEMBRANE Мд2+-АТРаве ACTIVITY OF LOACH EMBRYOS (Misgurnus fossilis L.)

M. V. Tselevych

Ivan Franko National University of Lviv 4, Hrushevskyi St., Lviv 79005, Ukraine

The functional confirmation of Са2+-independent, Mg2+-dependent ATPase presence in the loach Misgurnus fossilis L. embryo was obtained. It was found out

the periodic changes of ouabain-resistance basal Mg2+-АТРase activity at normal condi­tions during early stages of development. The influence of some bivalent metal cations as Cd2+, Zn2+, Mn2+ on Mg2+-АТPase activity of loach embryo (Misqurnus fossilis L.) during early embryogenesis was investigated. The determination at inhibition constants (І50) permitted to analyse this ATPase sensibility to the influence of metal cations during the synchronous blastomer divisions. The value of І50 during the investigated period of development confirmed higher inhibition influence of cations of Cd2+ and lower inhibition influence - for Zn2+ and Mn2+ cations.

Key words: basal Mg2+-dependent ATPase, loach embryos, plasma membrane, Cd2+, Mn2+, Zn2+, blastomers divisions.

ВСТУП

Для плазматичної мембрани (ПМ) багатьох видів клітин властива досить висока активність уабаїнрезистентної базальної Са2+-незалежної Mg2+-залежної АТФ-ази (Mg2+-АТФ-аза, EC 3.6.1.3), яку визначають за відсутності в інкубацій­ному середовищі Са2+ та за присутності Mg2+. Цю транспортну АТФ-азу виявлено, зокрема, в ПМ еритроцитів, клітин мозку, гепатоцитів, міоцитів судин і матки [11, 17, 19, 22]. Зокрема, у матці кролиць вона може становити 80+100 мкмолів Р(./год на 1 мг білка [2]. У зв'язку з виявленням у фракції ПМ реакції Mg2+-залежного гідролізу АТФ, для якого не потрібні іони Са2+, можна припустити, що він забезпечується базальною Са2+-незалежною Mg2+-АТФ-азою, котрій прита­манна фізіологічно висока спорідненість до іонів Mg2+ (Ка«107 мкМ) і яка є маркером цієї фракції, як і Na+, К+-АТФ-аза.

Фізіологічну роль Са2+-незалежного Mg2+-залежного ферментативного гідро­лізу АТФ у фракції ПМ досі не з'ясовано. Ймовірно, що ця функція неоднакова для різних тканин і об'єктів. Так, зокрема, в центральній нервовій системі Mg2+-АТФ-аза може гідролізувати АТФ у пресинаптичній і постсинаптичній мембранах, контролюючи таким чином концентрацію як АТФ, так і самого аденозину в синаптичній щілині [19]. Деякі автори [5, 16] не виключають, що Ca^-незалежна, Mg2+-залежна АТФ-аза ПМ клітин мозку риб є частиною АТФ-зв'язувальних ділянок на ГАМК-регуляторних Cl-каналах. Mg2+-АТФ-аза ПМ еритроцитів контро­лює їхню форму шляхом АТФ-залежної транслокації фосфатидилсерину та фосфатидил-етаноламіну з поверхневого шару ліпідів ПМ до внутрішнього [11]. На клітинах меланоми та в мембрані гладком'язових клітин трахеї виявлено асоціацію Mg2+-АТФ-ази з протонним насосом [12].

Молекулярні механізми токсичної дії деяких біологічно важливих металів часто пов'язують не лише з унікальними функціями цих металів, а й, що не менш важливо, з їх антагоністичними властивостями в реалізації транспортних процесів клітин. Відомо, що катіони двовалентних металів Ni2+, Cd2+, Mn2+, Co2+, Sr2+, Ba2+, Zn2+ [1], Cu2+ [23] та Pb2+ [24] інактивують таку мембранну систему транспорту, як Nа+, К+-АТФ-азу. Як свідчать дані Пекера та Лотерштайна [20], катіони Mn2+, Co2+, Zn2+ і Fe2+ також здатні заміняти Cа2+ у процесі Cа2+, Mg2+-залежного гідролізу АТФ везикулами мікросомної фракції гепатоцитів щурів. Відомості про здатність катіонів Cd2+, Mn2+ та Zn2+ модифікувати роботу базальної Са2+-незалежної Mg2+-залежної АТФ-ази є нечисленними, тому доцільним є дослідження впливу цихкатіонів на уабаїнрезистентний Mg^-залежний ферментативний гідроліз АТФ, зокрема, впродовж раннього ембріогенезу зародкових організмів.

Токсичний вплив кадмію пов'язаний з його кумуляцією в організмі, а також зі здатністю ініціювати вільнорадикальне окислення [21], що є причиною пошкод­ження мембранних та інших ліпопротеїнів, інактивації мембранних ферментів, пригнічення поділу клітин. У дослідженнях впливу на організм коропа лускатого (Cyprinus carpo L.) [6] іонів цинку, марганцю та свинцю, а також за умов їх суміс­ного впливу, спостерігали зміни активності супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази та посилення процесів пероксидації ліпідів, що свідчить про розбалансування системи антиоксидантного захисту. Як відомо, цинк, незва­жаючи на постійну валентність, істотно впливає на редокс-статус клітини, що надзвичайно важливо для зародкових клітин, через зміну співвідношення вмісту тіолів як у вільному стані, так і в координованих зв'язках з металом (враховуючи й Ме2+-зв'язуючі центри мембранних ферментів) [15].

Метою роботи було визначення питомої Са2+-незалежної базальної Mg^-АТФ-азної активності зародків Misgurnus fossilis L. та дослідження особливостей впливу катіонів Cd2+, Mn2+ та Zn2+ на уабаїнрезистентний Mg2+-залежний гідроліз АТФ.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження, проведені на зародках в'юна (Misgurnus fossilis L.) у період від запліднення до стадії 10 поділу бластомерів (2, 16, 64 бластомерів, 8 та 10 поділи). Ікру одержували через 36 год після стимуляціїхоріогонічним гонадотро-піном (500 од.) та запліднювали в чашках Петрі суспензією сперміїв за Нейфахом [7]. Після запліднення (через 5-10 хв) зиготи відмивали й інкубували у розчині Гольтфретера 0=21°С). Стадії розвитку контролювали візуально під бінокулярним мікроскопом МБС-9.

Мікросомну фракцію мембран зародків одержували методом диференцій-ного центрифугування у градієнті густини сахарози, як описано у статті [3]. Рештки зародкового жовтка осаджували центрифугуванням упродовж 10 хв при 1600 g. Надосадову рідину, збагачену фрагментами плазматичної та ретикулярної мембран, центрифугували 10 хв при 10 000 g і зберігали при t=20оС [3].

Перед початком експерименту аліквоту суспензії мембранного препарату (10 мкл) переносили у стандартне середовище інкубації, яке містило (ммоль/л): NaCl - 30,0; KCl - 125,0; MgCl2 - 3,0; АТФ-Na., - 3; Tris-HCl - 50,0 (рН 7,4; 21оС). Питому активність Ca2+-незалежної, Mg2+-залежної АТФ-ази визначали за відсут­ності іонів Ca2+, з додаванням 1 мМ ETTA та відповідних інгібіторів: 1 мМ уабаїну (інгібітор Na+, К+-АТФ-ази ПМ) та NaN3 (інгібітор АТФ-ази мітохондрій), 0,1 мкМ тапсигаргіну (інгібітор Ca2+, Mg2+-АТФ-ази ЕПР). Ферментативну реакцію ініціюва­ли введенням у реакційне середовище аліквоти мембранного препарату, а зупи­няли додаванням 10% ТХО.

Питому активність Mg2+-АТФ-азної системи досліджуваних клітин оцінювали за різницею між кількістю Р, що утворився в середовищі інкубації різного складу за наявності та відсутності фрагментів мембран, з урахуванням поправки на вміст ендогенного Р в мембранному препараті й виражали в мкмолях Р у перерахунку за 1 год на 1 мг білка. Кількість продукту реакції Р визначали за модифікованим методом Фіске-Суббароу [5], а вміст білка в суспензії мембранного препарату - за методом Лоурі [14]. Ймовірність одержаних показників визначали заґ-критерієм Стьюдента.

Для повноти характеристики варіабельності змін базальної активності Mg2+-АТФ-ази зародків за умов дії катіонів двовалентних металів визначено констант напівінгібування (І50), шляхом лінеаризації одержаних кривих доза-ефект у логарифмічних координатах. Числові значення І50для досліджуваних факторів на різних стадіях розвитку визначали у точці перетину одержаних прямих із віссю абсцис. Обчислення лінеаризованих графіків проводили з використанням найменших квадратів (значення r становило 0,90-0,99).

У роботі застосовували такі реактиви: EGTA, NaN3 („Merk", Німеччина), уабаїн („Fluka", Швейцарія), АТР („Acros", Бельгія), трис-гідроксиметил-амінометан, тапсиграгін („Sigma", США). Інші реактиви вітчизняного виробництва, кваліфікації х.ч. або ч.д.а.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

З огляду на дані літератури [2] можна припустити, що фракція бластодерм зародків є гетерогенною як за своєю топологією, так і за спектром активності локалізованих у ній АТФ-гідролаз (Na+, К+-; Ca2+, Mg2+-; Mg2+- та Са2+-АТФ-ази) і домішок фрагментів мембран інших субклітинних структур (мітохондрій, ЕПР), які здатні гідролізувати АТФ за наявності у середовищі іонів Mg2+.

Присутність 1 мМ ЕГТА у безкальцієвому, уабаїн- і азидвмісному середо­вищі інкубації практично унеможливлює ферментативний гідроліз АТФ Ca2+, Mg2+-АТФ-азами ПМ та ЕПР, Na+, К+-АТФ-азою ПМ та Ca2+АТФ-азою мітохондрій. Отже, за приріст Р. відповідає Mg^-АТФ-аза, середнє значення активності якої становить 2,4±0,3 мкмоль Р/год на 1 мг білка (рис. 1). У попередніх дослідах встановлено, що на стадії 2 бластомерів внесок активності Mg2+-АТФ-ази у загаль­ний Mg^-залежний ферментатив­ний гідроліз АТФ становить при­близно 39,7% (через 60 хв після запліднення) [9].

На стадії поділу 16 бластоме­рів (150-тахв) Mg2+-АТФ-азна ак­тивність зростає на 93,4±1,2% порівняно з першою стадією розвитку зародків і становить 4,6±0,6 мкмоль Р./год на 1 мг білка. За умов подальшої інкубації мікросомної фракції мембран зародків, на 210-й хв (рис. 1, ста­дія 64 бластомерів) за присутності уабаїну та азиду натрію (1 мМ), рівень Р. у безкальцієвому Mg2+-вмісному середовищі становив 3,8±0,5 мкмоль Р./год на 1 мг білка. Отже, відмічено зростання Mg2+-АТФ-азної активності в се­редньому на 57,1 ±7,6% відносно першої стадії розвитку зародків.

6,0-

5,0-

4,0-

***

л 3,0-

§

s

S 2,0­л"

Ё

n 1,0-s

E <

0,0-

60

150

210

270

330   час, хв

Рис. 1. Активність базальної Мд2+-АТФ-ази зародків в'юна на різних стадіях поділу бластомерів: * - р <0,05;** - р <0,01; *** - р <0,001 - зміни статистично достовірні порівняно зі стадією 2 бластомерів

Fig. 1.   Mg2+-ATPase activity of loach embryo at the dif­ferent stages of blastomer divisions. Significance level shown inside the figure, deter­mined by Student's t-test: * - р <0.05;** - р <0.01; *** - р <0.001

Максимального значення уабаїнрезистентна базальна Mg^-АТФ-азна актив­ність плазматичних мембран зародків в'юна досягала на восьмій стадії поділу бластомерів (270-та хв розвитку), становлячи 5,4±0,5 мкмоль Р/год на 1 мг білка (підвищується більше ніж на 124,2±10,8% відносно першої стадії розвитку). Як виявлено у ході досліджень, на десятій стадії поділу бластомерів (через 330 хв) не виявлено значних змін базальної Mg2+-АТФ-азної активності, однак на цій стадії спостерігали незначне зростання активності Mg^-АТФ-ази порівняно із попередньою стадією (рис. 1).

Отже, Mg^-АТФ-азна активність протягом синхронних поділів бластомерів зародків характеризується певною періодичністю. Однак на десятій стадії поділу бластомерів зміни активності Mg^-АТФ-ази збільшуються із тривалістю розвитку зародків. Слід зазначити, що подібний характер змін упродовж синхронних поділів виявлено і для Ca2+, Mg2+-АТФ-ази ПМ зародків в'юна [9]. Крім цього, встанов­лено, що максимального значення на восьмій стадії поділу також досягає Na+, К+-АТФ-аза, як і досліджувана уабаїнрезистентна базальна Mg2+-АТФ-аза зародків. Припускають, що такі зміни активності мембранозв'язаних ферментів пов'язані з підвищенням інтенсивності експресії молекул цих ферментів під час раннього ембріонального розвитку зародків. При дослідженні характеру роботи Nа+, К+-АТФ-ази на зародках морських їжаків Strongylocentrotus purpuratus i Litechinus pictus [13] показано, що активність її для незаплідненої яйцеклітини та при заплідненні майже ідентична, а швидке зростання Nа+, К+-АТФ-азної активності відбувається від стадії бластули до стадії ранньої гаструли, після чого залишається незмінною до стадії вилуплення. Подібні зміни Nа+, К+-АТФ-азної активності до стадії ранньої гаструли описано й для іншого виду морського їжака Hemicentrotus pulcherrimus [18]. У кінці періоду синхронних поділів бластомерів активуються макромолекулярні синтези, особливо масивний синтез нових мРНК [8], що потребує значних енерговитрат і приводить до перерозподілу макроергів, із чим, ймовірно, і пов'язана відсутність виражених змін ферментативної актив­ності енергозалежних систем транспорту на цьому етапі розвитку зародків.

При вивченні механізмів дії речовин різної природи значна увага приділяється особливостям їх взаємодії з ПМ, котра є найпершою ланкою у сприйнятті зовнішніх сигналів, їх проведенні та трансформації у клітинну відповідь. Одним із найбільш чутливих показників впливу речовин ендогенного і екзогенного поход­ження на стан ПМ є зміна активності мембранозв'язаних енергозалежних ферментів (АТФ-аз). Особливо актуальними є дослідження таких впливів на зародкових об'єктах, оскільки характер змін цих параметрів внаслідок впливу хімічних факторів у період раннього ембріогенезу відображають зміни функціо­нального стану, зокрема, й ступінь життєздатності організму, і можуть бути прогностичними показниками.

АТФ-гідролази, до яких належать Na+, К+-; Ca2+, Mg2+-; Mg2+, Н+- та Ca2+-АТФ-ази, мають низку спільних особливостей: є іон-транспортуючими ферментами, мають багато гомологічних послідовностей у молекулі білка, характеризуються подібним кінетичним механізмом [10]. Виходячи з цього та враховуючи високу чут­ливість АТФ-гідролаз до впливу факторів довкілля, зокрема, катіонів двовалентних металів, доцільно було б дослідити характер зміни активності базальної Mg^-АТФ-ази зародків за умов впливу катіонів Cd2+, Mn2+ та Zn2+, для розуміння ролі реакції уабаїнрезистентного Mg2+-залежного гідролізу АТФ у підтриманні іонного гомеостазу зародків упродовж розвитку.

Страницы:
1  2  3 


Похожие статьи

М В Целевич - Вплив катіонів двовалентних металівна базальну мд2+-атф-азну активність плазматичних мембран зародків в'юна