Л Дубицький, Л Вовканич, Н Наливайко - Вплив катіонів одновалентних металів на функціонування са2+н+-обмінника мітохондрій печінки щурів - страница 1

Страницы:
1 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF L'VIV UNIV.

Серія біологічна. 2006. Вип. 41. С. 103-108    Biology series. 2006. Is. 41. P. 103-108

Фізіологія людини і тварин

УДК 612.014.46:577.352.4

ВПЛИВ КАТІОНІВ ОДНОВАЛЕНТНИХ МЕТАЛІВ НА ФУНКЦІОНУВАННЯ СА2+/Н+-ОБМІННИКА МІТОХОНДРІЙ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ

Л. Дубицький, Л. Вовканич, Н. Наливайко

Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського 4, 79005, м. Львів e-mail: dubitsky@franko.lviv.ua

Виконано кінетичний аналіз властивостей Незалежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки. З'ясовано, що Км Н+-залежного виходу Са2+ з мітохо-ндрій для іонів Н+ становить 13,29 нМ, Vmax - 1,67 нмоль Са +/хв-мг білка, а коефіцієнт Хілла - 1,6. Швидкість Незалежного виходу Са2+ з мітохондрій від кількості акумульованого цими органелами Са2+ гіперболічна. Значення Кт Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій для іонів Са2+ становить 103,08 нмоль Са2+/мг білка, а Vmax - 2,16 нмоль Са2+/хв-мг білка. Доведено, що за фізіологічних значень рН (7,0-7,6) Са2+/Н+-обмінник функціонує у режимі Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій. Схарактеризовано залеж­ність інгібувального ефекту катіонів Tl+, Li+, Rb+, Cs+ та К+ на Н+-залежний вихід Са2+ з мітохондрій від їхніх фізико-хімічних параметрів.

Ключові слова: мітохондрії, кальцій-протонний обмінник.

У регулюванні функцій мітохондрій та підтриманні кальцієвого гомеостазу кліти­ни важливе місце посідають Са2-транспортні системи. Сьогодні є дані, що свідчать про можливу участь Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій у регулювання кальцієвого го­меостазу та метаболізму клітини [7, 11-13]. Отримано вагомі докази того, що це транспор­тування відбувається за участю системи Са2/Н+-обміну мітохондріальної мембрани [2, 3, 8, 10]. Проте властивості і механізми функціонування Са2+/Н+-обмінника мітохондрій вивчені не достатньо. Одним з важливих методичних підходів до дослідження механізмів функці­онування Са2+/Н+-обмінника є аналіз його взаємодії з катіонами інших одновалентних металів, що дає змогу з' ясувати фізико-хімічні механізми специфічності цієї транспорт­ної системи. Ми мали на меті з'ясувати фізико-хімічні механізми взаємодії Са2/Н+-обмінника мітохондрій печінки з катіонами одновалентних металів.

Дослідження проводили на ізольованих мітохондріях печінки щурів. Мітохондрії виділяли з печінки білих щурів методом диференційного центрифугування [2] з модифі­каціями, що дають змогу зменшити вміст кальцію у виділених мітохондріях [3]. Середо­вище виділення мітохондрій містило, мМ: сахароза - 300, трис - 10, ЕГТА - 1 (рН 7,4). ЕГТА із суспензії мітохондрій видаляли шляхом ресуспендування осаду та повторного центрифугування у середовищі виділення без ЕГТА. Вихід Са2+ з мітохондрій реєструва­ли за допомогою установки, зібраної на основі Са2+-селективного електрода фірми Orion (модель 93-20). Вихід кальцію з мітохондрій печінки вивчали після попередньої акумуля­ції ними Са2+ у середовищі інкубації такого складу, мМ: сахароза - 150, KCl - 50, KH2PO4 - 0,1, трис - 5 (рН 7,4, 26оС). У середовище інкубації вносили Са2+ (10-50 мкМ), мітохо­ндрії (3-4 мг білка), сукцинат (0,35 мМ); Н+-залежний вихід Са2+ з мітохондрій досліджу­вали в діапазоні концентрацій іонів Н+ у середовищі інкубації 5-150 нМ (рН 8,3-6,8). Реєстрування виходу Са2+ з мітохондрій розпочинали після внесення у середовище інку­бації блокатора Са2+-уніпортера цих органел - рутенію червоного (5 мкМ) [8]. Іони мета-

© Дубицький Л., Вовканич Л., Наливайко Н., 2006лів вносили у середовище інкубації мітохондрій у формі хлоридів. Зміни вмісту Са2+ у середовищі інкубації розраховували за калібрувальною кривою з урахуванням зв'язуван­ня кальцію компонентами середовища інкубації шляхом його титрування СаС12.

З'ясовано, що внесення у суспензію мітохондрій, які попередньо навантажували іонами Са2+, рутенію червоного (5 мкМ), ініціює вихід кальцію з цих органел. Швидкість виходу Са2+ з мітохондрій залежить від концентрації іонів Н+ у суспензії мітохондрій (рис. 1). Залежність швидкості Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки від поза-мітохондріальної концентрації іонів Н+ є сигмоподібною, що свідчить про кооператив-ність зв'язування Н+ з іонозв'язувальними центрами системи Н+-залежного виходу Са2+. Значення Vmax Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій становить 1,67 нмоль Са2+/хв«мг білка, Km для іонів Н+ - 13,29 нМ, коефіцієнт Хілла - 1,6. Швидкість Н+-залежного вихо-

V, нмоль Са2"*7хв мг білка

2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2

L / _,_,__

100   120   140 160

[Н+], нМ

Рис. 1. Залежність швидкості виходу Са2+ з мітохондрій від концентрації Н+ у позамітохондріаль-ному середовищі. Мітохондрії попередньо навантажували Са2+ у середовищі інкубації з концентрацією іона цього металу 10 мкМ (5 нмоль Са2+/мг білка): а - за віссю абсцис -концентрація Н+, нмоль/л; за віссю ординат - швидкість виходу Са2+ з мітохондрій V, нмоль Са2+/хв-мг білка; б - за віссю абсцис - логарифм концентрації Н+ у позамітохондріа-льному середовищі; за віссю ординат - 1og2 (V0 / (Vmax-V0)), де V0 - початкова швидкість транспортування за різних концентрацій іонів Н+; Vmax - максимальна швидкість для зада­них умов.

Фізико-хімічні параметри катіонів металів та ефективність інгібування ними Са2+/Н+-обмінника мітохондрій печінки

Параметри Са2+/Н+-обмінника і катіонів металів

Катіони металів

 

Н+

T1+

Li+

Rb+

К+

 

Інгібування Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій катіонами металів (I50, мМ)

-

0,328

158,68

183,26

413,57

2057,69

Потенціал іонізації,еВ *

13,599

6,108

5,392

4,177

4,341

3,894

Радіус іона за Полінгом, пм *

208

144

60

148

133

169

Електронегативність *

2,1

1,8

1,0

0,8

0,8

0,7

lg K1 (Ме-ЕДТА) *

-

6,53

2,79

0,59

0,55

0,15

Ентальпія гідратації, кДж/М**

1087,8

762,3

959,43

736,05

760,61

711,7

* Фізико-хімічні параметри катіонів металів за А.Т. Пилипенко [4]. ** Фізико-хімічні параметри катіонів металів за Г.А. Крестовим [5].ду Са2+ з мітохондрій від кількості акумульованого цими органелами Са2+ гіперболічна (рис. 2). Значення Кт Незалежного виходу Са2+ з мітохондрій для іонів Са2+ становить 103,08 нмоль Са2+/мг білка, а Vmax - 2,16 нмоль Са2+/хв-мг білка. Ці результати свідчать про наявність у внутрішній мембрані мітохондрій печінки Са2+/Н+-обмінника, який за фізіологічних умов життєдіяльності клітини (рН 7,0-7,6) функціонує в режимі Н+-залежного виходу Са2+ з цих органел. Коефіцієнт Хілла для іонів Н+, близький до двох, є ознакою стехіометрії обміну не менше ніж 2Н+:1Са2+.

Для з'ясування механізмів взаємодії катіонів одновалентних металів із Са2+/Н+-обмінником катіони цих металів вносили у суспензію мітохондрій до моменту стимулю­вання Н+-залежного виходу Са2+ рутенієм червоним. Для аналізу були підібрані іони ме­талів (T1+, Li+, Rb+, Cs+, К+), фізико-хімічні параметри яких, зокрема радіус іона, електро-негативність тощо, змінюються у достатньо широкому діапазоні значень (див. таблицю).

Виявлено, що внесення катіонів лужних металів у суспензію мітохондрій у конце­нтрації 0,1-40,0 мМ супроводжується дозозалежним пригніченням Са2+/Н+-обмінника цих органел. Ефективнішим інгібітором Са2+/Н+-обмінника мітохондрій виявився талій, інгібувальний ефект якого зафіксовано за концентрації 0,1-1,0 мМ (рис. 3).

Для оцінки ефективності інгібування Са2+/Н+-обмінника мітохондрій катіонами металів використано сталу напівінгібування І50, яку визначали у логарифмічних коорди­натах (рис. 4) [9]. Доведено, що за здатністю інгібувати Н+-залежний вихід Са2+ з мітохо­ндрій катіони одновалентних металів можна розмістити у такій послідовності (I50, мМ): T1+ (0,328) > Li+ (158,68) > Rb+ (183,26) > К+ (413,57) > Cs+ (2057,69).

Шляхом кореляційного аналізу виявлено, що ефективність інгібуванна Са2+/Н+-обмінника іонами одновалентних металів (I50) позитивно корелює зі спорідненістю їх до кисневмісних груп лігандів, зокрема ЕДТА (r = +0,6), а також зі значенням потенціалу іонізації (r = +0,7) та електронегативності (r = +0,6) атомів цих металів. Це свідчить, що транслокація Н+ Са2+/Н+-обмінником та інгібування її катіонами одновалентних металів, найвірогідніше, пов' язані із взаємодією їх з кисневмісними групами іонотранспортних центрів обмінника. Зареєстровано також позитивний кореляційний зв' язок ефективності

V, нмоль Са /хв мг білка

0.5

1/V

12.0

нмоль Са /мг білка

1/[Са2*]

Рис. 2. Залежність швидкості виходу Са2+ з мітохондрій від кількості акумульованого ними каль­цію. Мітохондрії попередньо навантажували Са2+ у середовищі інкубації з концентрацією іона цього металу 10-50 мкМ (+5-25 нмоль Са2+/мг білка): а - за віссю абсцис - вміст каль­цію у мітохондріях, нмоль Са2 /мг білка; за віссю ординат - швидкість виходу Са2+ з міто­хондрій V, нмоль Са2+/хв-мг білка; б - за віссю абсцис - обернена величина концентрації Са2+; за віссю ординат - обернена величина швидкості виходу Са2+ з мітохондрій.

Рис. 3. Вплив катіонів одновалентних металів на швидкість Н+-залежного виходу кальцію з міто-хондрій печінки. За віссю абсцис - концентрація іонів талію та інших одновалентних металів у позамітохондріальному середовищі ([Me+,T1+]), мМ, за віссю ординат - швид­кість Н+-залежного виходу Са2+ (V), %. Умови інкубації див. на рис. 1.

Рис. 4. Лінеаризація дозових залежностей інгібування НҐ-залежного виходу Са2+ з мітохондрій у логарифмічних координатах [9] За віссю абсцис - логарифм концентрації іонів одновален­тних металів; за віссю ординат - логарифм частки неінгібованої швидкості Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій.

інгібування (I50) обмінника катіонами металів з ентальпією їхньої гідратації та негатив­ний кореляційний зв' язок ефективності цього інгібування з кристалографічним радіусом цих металів (r = -0,6). Ці результати засвідчують, що процеси транслокації Н+ обмінни-ком та її інгібування катіонами одновалентних металів супроводжуються процесами дегі-дратації-гідратації іонів цих металів. Дегідратація іонів одно- і двовалентних металів супроводжує також транслокацію цих іонів №+/Са2+-обмінником плазматичної мембрани клітин [1, 6]. Це є ознакою подібності фізико-хімічних механізмів транслокації іонів іон­ними обмінниками плазматичної мембрани і мембрани мітохондрій клітин.

Отже, у внутрішній мембрані мітохондрій функціонує Са2+/Н+-обмінник, який здатний здійснювати за фізіологічних умов Н+-залежний вихід Са2+ з матриксу цих ор-ганел зі стехіометрією обміну не менше 2Н+ : 1Са2+. Катіони одновалентних металів пригнічують Н+- залежний вихід Са2+ з мітохондрій. Ефективність інгібування Са2+/Н+-обмінника зростає зі збільшенням спорідненості іонів одновалентних металів до киснев­місних лігандів, ентальпії їхньої гідратації та зі зменшенням їхнього кристалографічно­го радіуса. Виконаний аналіз свідчить, що транслокація Н+ Са2+/Н+-обмінником мітохо-ндрій та інгібування його катіонами одновалентних металів пов' язані із взаємодією цих іонів з кисневмісними групами іонотранспортувальних центрів обмінника і, вірогідно, супроводжуються процесами зворотної дегідратації-гідратації.

Робота виконана за підтримки Державного фонду фундаментальних досліджень (ДФФД) України, ґрант № Ф7/210-2004.

1. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С. Взаємодія катіонів лужноземельних і перехідних металів з Ма+/Са2+-обмінником плазматичної мембрани секреторних клітин шлун­кових залоз // Укр. біохім. журн. 2001. Т. 73. № 6. С. 41-49.

2. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С. Кінетичні властивості Н+-стимульованого виходу Са2+ з мітохондрій печінки // Експерим. та клінічна фізіологія та медицина. 2001. №3. С. 12-17.

3. Дубицький Л., Вовканич Л. Крив'як Н. Інгібіторний аналіз взаємодії катіонів мета­лів з Са2+-Н+-обмінником ізольованих мітохондрій печінки // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. 2003. Вип. 32. С. 172-177.

4. Краткий справочник по химии / Под ред. А.Т. Пилипенко. К.: Наук. думка, 1987.

829 с.

5. Крестов Г.А. Термодинамика ионных процессов в растворах. Л.: Химия, 1973.

304 с.

6. Федірко Н.В. Характеристика струму та властивості Na-Ca-обміну мембрани секре­торних клітин: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. 1997. 18с.

7. Babsky A., Doliba Nic., Doliba Nat. et al. Na+ effects on mitochondrial respiration and oxidative phosphorylation in diabetic hearts // Exp. Biol. Med. 2001. Vol. 226. N 6. P. 543-551.

8. Bernardi P. Mitochondrial transport of cations: Channels, exchangers, and permeability transition // Physiol. Rev. 1999. Vol. 79. N 4. P. 1127-1155.

9. Chou T.C. Derivation and properties of Michaelis-Menten type and Hill type equations for reference ligands // J. Teor. Biol. 1976. Vol. 59. N 2. P. 253-276.

10. Gunter T.E., Gunter K.K., Sheu S-S., Gavin C.E. Mitochondrial calcium transport: physiological and pathological relevance // Amer. J. Physiol. 1994. P. C313-C339.

11. Lee B., Miles P.D., Vargas L. et al. Inhibition of Mitochondrial Na+-Ca2+ Exchanger Increases Mitochondrial Metabolism and Potentiates Glucose-Stimulated Insulin Secretion in Rat Pancreatic Islets // DIABETES. 2003. Vol. 52. P. 965-973.

12. Rizzuto R., Bernardi P., Pozzan T. Mitochondria as allround players of the calcium game // J. of Physiology. 2000. Vol. 529. N 1. P. 37-47.

13. Yang F., Xiang-He X., Russell J., Lu B. Ca2+ influx-independent synaptic potentiation mediated by mitochondrial Na+-Ca2+ exchanger and protein kinase C // J. Cell Biology. 2003. Vol. 163. N 3. P. 511-523.

THE INFLUENCE OF MONOVALENT METALS CATIONS ON THE FUNCTIONING OF CA2+/H+-EXCHANGER OF RAT LIVER MITOCHONDRIA

L. Dubitsky, L. Vovkanych, N. Kryvjak

Ivan Franko National University of Lviv Gryshevskogo st. 4, 79005, Lviv e-mail: dubitsky@franko.lviv.ua

Kinetic analysis of H+-dependent Ca2+ efflux from rat liver mitochondria has been performed. The Км value of H+-dependent Ca2+ efflux from mitochon­dria for H+ ions is 13.29 nM, Vmax - 1,67 nmol Са2+/гпш-пщ protein, and Hill coefficient - 1,6. The hyperbolic concentration dependence between velocity of H+-dependent Ca2+ efflux from mitocho+ndria and amo2u+nt of accumulated Ca2+ has been revealed. The Кш value of H+-dependent Ca2+ efflux from mitochon­dria for Ca2+ ions is 103.08 nmol Са2+/п^ prote2n, and Vmax - 2.16 nmol Са2+/ min-mg protein. It confirms the H+-dependent Ca2+ efflux mode of mitochondria Ca2+/H+-exchanger functioning under the p+hysio+logic+al lev+els of p+H (7,0-7,6). Th+e dependence o2+f inhibitory effects of Tl+, Li+, Rb+, Cs+ and К+ ions on the H+-dependent Ca2+ efflux from mitochondria from their physicochemical pa­rameters has been described.

Key words: mitochondria, calcium-proton exchanger.

Стаття надійшла до редколегії 05.07.05 Прийнята до друку 01.08.05

Страницы:
1 


Похожие статьи

Л Дубицький, Л Вовканич, Н Наливайко - Вплив катіонів одновалентних металів на функціонування са2+н+-обмінника мітохондрій печінки щурів