Я Ковалишин, С Парижак, Б Остапович - Вплив природи електродів на біоаналітичні характеристики біосенсора для визначення формальдегіду - страница 1

Страницы:
1 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK LVIV UNIV.

Серія хім. 2008. Bun. 49. Ч. 2. С. 173-178    Ser. Khim. 2008. No 49. Part 2. P. 173-178

УДК 541.138

ВПЛИВ ПРИРОДИ ЕЛЕКТРОДІВ НА БІОАНАЛІТИЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ БІОСЕНСОРА ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ФОРМАЛЬДЕГІДУ

Я. Ковалишин1, С. Парижак2, Б. Остапович1, Б. Вус3

1 Львівський національний університет імені Івана Франка, вул. Кирила і Мефодія, 6, 79005 Львів, Україна

2Інститут біології клітини НАН України, вул. Драгоманова, 14/16, 79005 Львів, Україна

3Національнийуніверситет „Львівська політехніка", вул. С. Бандери, 12, 79013 Львів, Україна

Досліджено функціонування ензимних електродів, електрохімічний потенціал яких змінюється пропорційно до концентрації формальдегіду в аналіті. Визначено параметри робо­чих електродів біосенсора підібраної конфігурації, виготовлених на основі різних матеріалів.

Ключові слова: електрохімічні біосенсори, формальдегід, вольтамперометрія, електропровідні полімери.

Успішний розвиток досліджень на стикуванні різних наук привів до появи нового напряму в аналітичній хімії - хімічних сенсорів, а використання біологічних матеріалів для розпізнавання певних молекул і видача інформації про їхню наявність та кількість у ви ляді електрично о си налу - до виникнення біосенсорів (біоелектронних пристроїв). На сьогодні електрохімічні сенсори є найпоширенішими на ринку біоаналітичних пристроїв, хоча простежується значний інтерес дослідників й до інших типів сенсорів, у тім числі до оптичних [1].

Для створення біосенсорів, датчики яких містять біохімічний селективний шар, що дає відгук на формальдегід у досліджуваному розчині, ми апробували амперметричний тип електрохімічних сенсорів, робочі електроди яких мали різну конфігурацію і були виготовлені з різного матеріалу. У зв'язку з високою токсичністю та реакційною здатністю формальдегіду, з низькими концентраціями якого постійно контактують усі без винятку люди в промислово розвинених країнах, необхідно ретельно контролювати вміст цієї речовини у середовищах довкілля, промислових товарах і медичних препаратах, в озонованій питній воді, а в деяких випадках навіть у харчових продуктах. Тому розроблення сучасних високочутливих та селективних методів моніторин у формальде іду в середовищах довкілля та харчових продуктах є актуальною проблемою.

На поверхню робочо о електрода за допомо ою дозатора наносили розчини компонентів біоселективно о шару, які в подальшому іммобілізувались на йо о поверхні методом електрохімічно о осадження. До складу ферментної системи, яка є

© Ковалишин Я., Парижак С, Остапович Б. та ін., 2008селективною до формальде іду, належали енно-інженерна формальде ідде ідро е-наза (ФдГД), виділена із рекомбінантного штаму дріжджів Hansenula polymorfa [2, 3], її кофактори NAD+і глутатіон (GSH), а також осмієвий комплекс [Os(Me2bpy)2Cl2] як медіатор (наданий професором В. Шуманном, Рурський ун-т, м. Бохум, ФРН), який при катодному електроосадженні переходить у нерозчинну форму, захоплюючи із розчину молекули ферменту [4]. При цьому на поверхні робочо о електрода енеруються ідроксил-іони (ОН-), які, взаємодіючи з аміно рупами катодно о полімеру, депротонують їх, що призводить до осадження полімеру та іммобілізації ФдГД на поверхні робочих електродів.

З метою визначення впливу природи матеріалу та конфігурації робочого електрода на біоаналітичні характеристики електрохімічних біосенсорів для визна­чення вмісту формальде іду у досліджуваному розчині ми сконструювали декілька типів робочих електродів біосенсора. Використовували такі струмопровідні поверхні, як золото, платина і графіт. Електроди мали форму стержнів довжиною 5 мм, діаметром 0,5 мм, (площа поверхні 7,85 мм2) і були розміщені в комірці полістироль-но о корпуса. Крім то о, використовували рафітову поверхню у конфі урації дискового торцевого електрода діаметром 6 мм (площа поверхні 28,25 мм2).

Аналітичний сигнал, який дає пряму інформацію про вміст визначуваного компонента в розчині, фіксували за допомо ою комплексу апаратури для електрохімічних досліджень.

Важливою умовою, яка визначає селективність амперметрично о сенсора, є потенціалелектрода. Електроактивні речовини здатні до перетворенняпри заданому потенціалі, де енерований струм вносить вклад у величину за ально о струму, який є інформативним параметром. Дляусуненнявпливу ор анічних складових реакційної суміші, які співокиснюються, підтримують якомо а нижчий потенціал робочо о електрода. Ми дослідили електрохімічну поведінку сенсора із графітовим робочим електродом у 50 мМ фосфатному буферному розчині (рН=8,0) (див. рис. 1). При додаванні формальде іду в області потенціалів робочо о електрода +0,3-+0,4 В простежується максимум збільшення струмів. При амперметричному визначенні формальде іду сформований ензимний електрод поміщали у триелектродну електрохімічну комірку, заповнену буферним розчином (рН=8,0), післявстановлення рівноважно о струму додавали дозовані кількості розчину формальде іду (800 мМ), фіксуючи зміну сили струму в колі допоміжно о та робочо о електрода при потенціалі +0,4 В.

Принцип амперметричної детекції формальде іду поля ає у енерації струму на робочому електроді в процесі передачі електронів від аналіту через посередництво NAD+ і синтетичного медіатора [5]:

HCOH + NAD+ + H2O 4 ФдДГ GSH 4 HCOOH + NADH + H+ HCOH + GSH = GS-CH2OH

ФдДГ GS-CH2OH + NAD+ 5 GS-CHO + NADH + H+ GS-CHO + H2O 5 GSH + HCOOH 2Osox + NADH 4 2Osred + NAD+ + H+

Osred 4 OSox + Є-

О 10

8 6 4 2

0

-2 -4 -6 -8 -10

-12 -14 -16 - 0 мМ ФА 15,7 мМ 45,3 мМ

-0,2   -0,1    0,0    0,1    0,2    0,3    0,4    0,5    0,6    0,7 0,8

Потенціал, мВ

Рис. 1. Циклічна вольтамперограма біосенсора у 50 мМ фосфатному буферному розчині (рН=8,0) за різних концентрацій формальдегіду. Швидкість розгортки потенціалу 2 мВ/с. Робочий електрод - графітовий (7,85 мм2). Допоміжний електрод - платиновий, відокремлений від робочого скляною мембраною, електрод порівняння - насичений срібно-хлорсрібний ЭВЛ-1 М

Схематичне зображення перебігу реакції в формальдегіддегідрогеназному амперметричному біосенсорі для виявлення формальдегіду наведено нижче:

нсоон

G-SCH20H

G-SH

На рис. 2 зображено рафічну залежність сили струму від часу при додаванні в електрохімічну комірку частин розчину формальде іду. На основі одержаних експериментальних даних побудовано калібрувальні криві для біосенсорів із робочими електродами з різного матеріалу (див. рис. 3).

Для сконструйованих біосенсорів лінійність залежності сила струму-концент-рація є в межах (0-15 мМоль формальдегіду), максимальна сила струму відклику сягає ~15,0 мкА (платина). Одержані дані засвідчують, що за умови однакової площі поверхні робочого електрода (;7,85 мм2) чутливість свіжовиготовлених амперметричних біосенсорів змінюється від 0,05 ( рафіт) до 0,32 (золото) і до 1,65 мкА/ммоль (платина), відповідно, величина струмів відклику біосенсора зростає у ряду графіт < золото < платина. Електропровідний матеріал, з якого виготовлено робочий електрод, йо о хімічна активність (а також, очевидно, чистота поверхні, кристалічна структура електрода та ступінь йо о окисненості) впливають на форму поляризаційних кривих ор анічних сполук, які беруть участь в електрохімічній реакції, що й проявляється на величині граничних струмів [6].

0,010 0,008 < 0,006

£ 0,004

О

0,002 0,000

+30 - об'єм доданого 800 мМ розчину FA (мкл)

15

25 30

Час, хв

40

Рис. 2. Хроноамперметрична крива визначення формальдегіду за допо-мо ою амперметрично о сенсора. Матеріалробочо о електрода -золото. Потенціал електрода +0,4 В

30 25

£ 20

І 15

О

10

10

15

20

25

Концентрація ФА, мМ

Рис. 3. Калібрувальні криві визначення формальдегіду за допомогою амперметричних сенсорів на основі платини (1), золота (2) та графіту (3). Потенціал електрода +0,4 В

Одним із етапів при конструюванні біосенсорів є іммобілізація ферменту на струмопровідних матеріалах, яка передбачає адсорбцію макромолекул білкової речовини на металічній, оксидній або рафітовій поверхні. На рис. 4 зображено калібрувальні криві для амперметрично о визначення формальде іду з викорис­танням однотипних електродів ( рафіт) з різною величиною площі поверхні.

Збільшення площі поверхні електрода при формуванні на ньому біочутливого шару за інших однакових умовах веде до зростанняструму відклику амперметрич­ного сенсора, що, очевидно, пов'язано зі збільшенням кількості електрон-продукую-чих центрів, поліпшенням доступу молекулсубстрату до активних центрів біоло ічно активних білків унаслідок ви іднішо о просторово о розміщення біокаталізатора, а також поле шенням перенесення електронів між ферментами і електродом завдяки оптимальнішій орієнтації ферментів і медіаторів стосовно поверхні електрода [7].

+400

+800

+200

+ 100

+60

+60

+30

20

35

2

5

3

0

0

5

Рис. 4. Калібрувальні криві визначення формальде іду за допомо ою ампер­метричних сенсорів на основі рафітових електродів з різною площею поверхні: 1 - 28,25 мм2; 2 - 2,5 мм2. Потенціал електрода +0,4 В

Ми дослідили працездатність рафітово о та платиново о ферментних електродів від часу зберігання (електрод поміщали у буферний розчин при +5 оС). Як видно із рис. 5, навіть через 7 днів досліджувані електроди проявляють здатність реа увати на зміну концентрації формальде іду в аналіті, проте максимальний струм і чутливість знижуються на 90 та 60 % від початкових значень, відповідно.

5 1 1,6

1,2

£ 0,8

0,4

0,0 J

З графіт і платина

0.16

U0.12

0.08

Н0.04

L 0.0

2

4

3

5

6

Рис. 5. Залежність чутливості біосенсорів з різною природою електрода від часу зберігання: 1, 2 - одразу після виготовлення; 3 - 2 год після виго­товлення; 4 - 2 доби після виготовлення; 5, 6 - 7 діб після виготовлення

Можна зробити висновок, що досліджені струмопровідні електроди є придат­ними дляви отовленняферментних електродів формальде ідно о біосенсора. Вели­чина відклику амперметрично о сенсора залежить від природи та величини поверхні електрода, ся аючи максимальних значень у випадку застосування платини. Дина­міка зміни операційної стабільності біосенсора від часу збері ання є ліпшою для рафітово о електрода, очевидно, у зв' язку з каталітичною активністю поверхні платини в реакціях окиснення адсорбованих ор анічних та білкових речовин, які призводять до зниженняактивності ферментної системи.

1. Будников Г.К., Майстренко В.Н., Муринов Ю.И. Вольтамперометрия с модифицированными и ультрамикроэлектродами. М.: Наука, 1994.

2. Демків ОМ., Парижак С.Я., Красовсъка О.С. та ін. Конструювання штамів -надпродуцентів формальдегіддегідрогенази метилотрофних дріжджів Hansenula polymorfa. Біополімери і клітина. 2005. Т. 21. № 6. С. 525-529.

3. Demkiv O.M., Paryzhak S.Ya., Gayda G.Z., Sibirny V.A., GoncharM.V. Formaldehyde dehydrogenase from the recombinant yeast Hansenula polymorpha: іsolation and bioanalytic application // FEMS Yeast Research. 2007. Vol. 7. P. 1153-1159.

4. Reiter S., Ruhlig D., Ngounou B., Neugebauer S., Janiak S. et al. An Electrochemical Robotic System for the Optimization of Amperometric Glucose biosensors Based on a library of Cathodic Electrodeposition Paints // Macromol. Rapid Commun. 2004.

Vol. 25. P. 348-354.

5. Nikitina O., Shleev S., Gayda G., Demkiv O., Gonchar M. et al. Bi-enzyme biosensor based on NAD+- and glutathione-dependent recombinant formaldehyde dehydrogenase and diaphorase for formaldehyde assay // Sensors and Actuators B. 2007. Vol. 125. P. 1-9.

6. Байзер М.М. Органическая электрохимия / Пер. с анг. под ред. В.А. Петросяна, Л.Г. Феоктистова. В 2-х т. М., 1988.

7. Тарасевич М.Р., Богдановская ВА., Жутаева Г.В. Электрохимические биосенсоры / Электрохимия. 1993. Т. 29. № 12. С. 1554-1560.

ELECTROCHEMICAL BIOSENSORS FOR FORMALDEHYDE DETERMINATION

Ya. Kovalyshyn1, S. Paryzhak2, B. Ostapovych1, B. Vus3

1 Ivan Franko Lviv National University, Kyryla & Mefodiya Str., 6, 79005 Lviv, Ukraine

2Institute of Cell Biology, Dragomanov Str., 14/16, 79005 Lviv, Ukraine

^National University "Lviv Polytechnica", S. Bandera Str., 12, 79013 Lviv, Ukraine

Explored functioning of enzym electrodes electrochemical potential of which changes proportionally to the concentration of formaldehyde in analyte. The parameters of workings electrodes of biosensor of neat configuration, made on the basis of different materials are set.

Key words: electrochemical biosensors, voltammetry, conducting polymers.

Статтянадійшла до редколе ії 31.10.2007 Прийнята до друку 03.01.2008

Страницы:
1 


Похожие статьи

Я Ковалишин, С Парижак, Б Остапович - Вплив природи електродів на біоаналітичні характеристики біосенсора для визначення формальдегіду