І Кушкевич - Вплив різних концентрацій pb2+ на фізіолого-біохімічні властивості фототрофних сіркобактерій chromatium okenii - страница 1

Страницы:
1  2 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF L VIV UNIV.

Серія біологічна. 2008. Віт. 46. С. 137-146 Biology series. 2008. Is. 46. P. 137-146

УДК 579.811.2/3:546.81

ВПЛИВ РІЗНИХ КОНЦЕНТРАЦІЙ PB2+ НА ФІЗІОЛОГО-БІОХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ФОТОТРОФНИХ СІРКОБАКТЕРІЙ CHROMATIUM OKENII

І. Кушкевич, С. Гнатуш, С. Гудзь, О. Кулачковський, А. Федорович

Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського, 4, 79005 Львів, Україна e-mail: Ivan_Kushkevych@ukr.net

Вивчено ріст культури Chromatium okenii у середовищі Ван Ніля за впливу різних концентрацій іонів плюмбуму. Показано, що внесення Pb2+ у середовище пригнічує ріст фототрофних сіркових бактерій. Визначено швидкість поглинання кисню культурою сіркових бактерій C. okenii при рості у середовищі з додаванням іонів плюмбуму. Проведено аналіз спект­рів поглинання пігментів пурпурових сіркобактерій за різних концентрацій Pb2+. Визначено якісний і кількісний склад основних фотосинтезувальних пігментів у клітинах за цих умов. З'ясовано, що ультраструктура клітин C. okenii зазнає змін під впливом іонів плюмбуму.

Ключові слова: пурпурові сіркобактерії, плюмбум, токсичність, поглинання кисню, бактеріохлорофіли, каротиноїди.

Антропогенне забруднення біосфери важкими металами впливає на всі живі ком­поненти біоценозів. Під впливом цих сполук змінюється не тільки склад мікробних угруповань, але й фізіолого-біохімічні властивості їх представників [1]. Плюмбум за­ймає особливе місце серед полютантів унаслідок широкого діапазону впливу його спо­лук на всі системи та функції організму, різноманітності захворювань у людини, зумов­лених свинцевою інтоксикацією [11, 12].

Не описано участі плюмбуму у жодному з процесів, які відбуваються в живих організмах. Він не входить до складу ферментів, що відрізняє його від купруму, цинку, молібдену, кобальту та інших важких металів. Однак навіть невеликі його концентрації негативно впливають на метаболізм клітини [1].

Механізм токсичної дії плюмбуму на клітини бактерій недостатньо вивчений. Відо­мо, що біоенергетичні параметри (мембранна АТФ-аза і трансмембранний потенціал) бак­теріальних клітин є індикаторами впливу компонентів навколишнього середовища, в тому числі важких металів. Плюмбум виявляє інгібуючу дію на АТФ-азну активність плазмати­чної мембрани. Необхідною умовою фізіологічного рівня трансмембранного потенціалу бактерій є цілісність плазматичної мембрани [21]. Відомо, що двовалентні катіони мета­лів, зокрема Pb2+, можуть взаємодіяти із фосфоліпідами мембрани, утворювати з ними специфічні комплекси, які обумовлюють виникнення механічного напруження, яка в свою чергу викликає появу дефектів та порушення функції мембрани [20, 21].

Іони плюмбуму мають здатність взаємодіяти із електрон-донорними групами органічних сполук, утворюючи комплекси із гідроксильними, карбоксильними, фосфат­ними й аміногрупами, а також ковалентні зв'язки із сульфідгідридними групами, що призводить до пригнічення росту мікроорганізмів у результаті порушення структури поверхневих шарів клітини, цитоплазматичної мембрани, органел, а також інгібування окремих процесів метаболізму [19, 21].

© Кушкевич І., Гнатуш С, Гудзь С. та ін., 2008

Метою нашої роботи було дослідження впливу Pb2+ на ріст, швидкість поглинан­ня кисню культурою Chromatium okenii, синтез і спектральні характеристики пігментів, їх якісний та кількісний склад.

У роботі використовували культуру пурпурових сіркобактерій Chromatium okenii, виділену із водойм Яворівського сіркового родовища [3].

Бактерії вирощували у рідкому середовищі Ван Ніля протягом 10 діб за анаероб­них умов при температурі 20-23°С і постійному освітленні лампою розжарювання із використанням червоного світлофільтра [29]. Анаеробні умови досягали, заповнюючи пробірки на 20 мл середовищем так, щоби під гумовим корком не залишалося міхурців повітря.

Для дослідження впливу різних концентрацій Pb2+ на ріст фототрофних сіркобак­терій його вносили в середовище у вигляді плюмбум нітрату у концентраціях 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 та 2,5 мМ (у перерахунку на концентрацію іонів плюмбуму). Бактерії C. okenii вирощували протягом 10 діб у середовищі Ван Ніля. У контрольні варіанти не вносили солі плюмбуму. Біомасу культури визначали за мутністю суспензії клітин фотоелектро-колориметрично, використовуючи КФК-3 (Х=660 нм, оптичний шлях 3 мм).

Полярографічне вимірювання швидкості поглинання кисню сіркобактеріями ба­зується на реєстрації електрохімічного відновлення фізично розчиненого кисню на ка­тоді при накладанні потенціалу 0,6-0,7 В. Величину дифузного струму реєстрували за допомогою полярографічної установки, зібраної на базі закритого електрода Кларка, самописця КСП-4, магнітної мішалки для розмішування суспензії та скляної термоста-тованої закритої комірки об'ємом 1 мл.

Температура інкубації клітин підтримувалась на рівні +26°С термостатуючою водяною банею. Напруження кисню у розчині визначали за допомогою електрополяро-графа у нг атом О. Зміни напруження кисню під час досліду реєстрували за допомогою самописця КСП-4 на паперовій стрічці, швидкість руху якої 1800 мм/год.

Поглинання кисню визначали за кутом нахилу кривої. Швидкість поглинання кисню виражали у нг атом О /хв-мг клітин. У комірку почергово вносили 1 мл суспензії культури C. okenii, яка вирощена при різних концентраціях Pb2+ (0,5, 1,0, 1,5, 2,0 та

2,5 мМ) [16].

Для визначення якісного та кількісного складу фотосинтезувальних пігментів клітини C. okenii центрифугували протягом 30 хв при 8000 об/хв. Надосадову рідину зливали, а одержану біомасу наносили на поверхню скла і висушували при температурі 40°С. Висушені клітини руйнували розтиранням із кварцовим піском [13].

Пігменти екстрагували сумішшю етанолу та ацетону в об'ємному співвідношенні 1:1 до повного знебарвлення осаду. Одержані екстракти використовували для реєстрації електронних спектрів поглинання [13, 14, 26].

Хроматографічне розділення пігментів на окремі компоненти проводили на силу-фолових пластинках ("Sorbfil", Росія) у висхідному потоці системи розчинника бен-зин:ацетон:петролейний ефір:гексан в об'ємному співвідношенні 10:10:3:10 [13]. Стан­дартними зразками (свідками) були астаксантин із панцира креветок та /?-каротин із клітин гриба Blakeslea trispora.

Ідентифікацію пігментів проводили за забарвленням на хроматограмах, величи­нами Rf та максимумами поглинання при різних довжинах хвиль [24, 25, 27].

Спектри поглинання інтактних клітин пурпурових сіркобактерій і екстрагованих пігментів   записували   у   видимій   та   ультрафіолетовій   ділянках   спектра нареєструвальному двопроменевому спектрофотометрі "Specord M-40". Вміст основних пігментів клітин C. okenii розраховували на 1 г сухої маси [13]. Концентрації основних пігментів пурпурових сіркобактерій розраховували за формулою:

C = D

E l

•>

де С - концентрація пігменту, г/л; D - оптична густина розчину, E - питомий коефіцієнт екс­тинкції відповідного пігменту (Екар - 271,8 при 474 нм, Ебхл - 930,0 при 770 нм), л - г-1 см-1; l - товщина поглинаючого шару, см.

Вміст пігментів з розрахунку на 1 г сухої ваги клітин обчислювали за формулою:

4   CV K

A =-

H

де A - кількість пігменту на 1 г сухої ваги клітин (мг/г); С - концентрація пігменту, г/л; V - об'єм екстракту, мл; H - наважка клітин, г; K - відношення об'єму елюату до об'єму розчину, нанесеного на хроматограму.

Для електронномікроскопічних досліджень клітини двічі відмивали дистильова­ною водою та осаджували центрифугуванням при 10000 об/хв протягом 15 хв. Клітини фіксували в 1,5% водному розчині KMnO4 упродовж 20 хв при кімнатній температурі. Постфіксацію проводили з використанням 1% OsO4 у какодилатному буфері протягом 90 хв при 0°С. Фіксовані клітини промивали, обезводнювали в розчинах зі зростаючими концентраціями етанолу і окису пропілену. Зразки переносили в епоксидну смолу Epon 812. Ультратонкі зрізи отримували на ультрамікротомі УМТП-6 і контрастували цитра­том плюмбуму за Рейнольдсом [30].

Перегляд і фотографування зразків проводили на електронних трансмісійних мікроскопах УЕМВ-100 Б і ПЕМ-100 при прискорюючій напрузі 75 кВ. Кінцеве збіль­шення на мікрофотографіях - 6000-8000 разів.

Вираховували основні статистичні показники за експериментальними даними (середнє арифметичне - М; стандартна похибка середнього арифметичного - m). Для оцінки достовірності різниці між статистичними характеристиками альтернативних су­купностей даних обчислювали коефіцієнт Стьюдента [10]. Достовірною вважалася різниця при Р>0,95. Статистичне опрацювання результатів проводили, використовуючи програми Excel та Origin.

Початкова біомаса культури становила 0,78±0,01 г/л. Проби для визначення біомаси відбирали на першу, другу, третю, четверту, шосту, восьму та десяту доби. Ре­зультати досліджень представлені на рис. 1.

Як видно з рис. 1, при вирощуванні культури C. okenii у середовищі Ван Ніля без плюмбуму (контроль) на восьму добу росту біомаса є максимальною і становить 3,95±0,01 г/л. На десяту добу культивування біомаса не змінювалася, тобто культура перейшла у стаціонарну фазу росту. У присутності 0,5 мМ Pb2+ від другої до третьої діб спостерігали уповільнення росту, після чого біомаса зростала до восьмої доби, її макси­мальне значення було 3,79±0,01 г/л.

При додаванні у середовище Pb2+ в концентрації 1,0 мМ значний ріст культури спостерігали на першу та другу доби вирощування, на третю-четверту доби ростові про­цеси уповільнювалися. Значне збільшення біомаси відмічено на шосту (3,44±0,01 г/л) добу росту, після чого культура переходила у стаціонарну фазу росту.

.4 -

«г о 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0

0,5 0,0

К

—•—

0,5 мМ

a—

1,0 мМ

t—

1,5 мМ

—♦—

2,0 мМ

—4 —

2,5 мМ

Час культивування, доби

Рис. 1. Ріст культури C. okenii за різних концентрацій Pb +.

Незначним (порівняно з контролем) був ріст культури C. okenii у присутності 1,5 мМ Pb2+ та 2,0 мМ (рис. 1). Спостерігали уповільнення росту на 2-4 доби культивуван­ня, після чого біомаса зростала до восьмої доби (3,46±0,01 г/л) при 1,5 мМ та 3,09±0,01

г/л при - 2,0 мМ Pb2+.

Найслабший ріст культури C. okenii відмічено в присутності 2,5 мМ Pb2+. Він інгібувався на 66,75%.

Таким чином, протягом перших двох діб вирощування біомаса культури C. okenii при всіх досліджуваних концентраціях іонів плюмбуму значно зростає, порівняно з вихід­ною. Можливо, клітини поглинають Pb2+ протягом цього часу. Ймовірно, після проник­нення в клітину метал зв'язується з білками цитоплазми і внутрішніми мембранними структурами [18]. Присутність плюмбуму у клітині викликає уповільнення процесів клі­тинного поділу, транспорту цукрів, порушення проникності клітинної мембрани [20]. Але в подальшому біомаса зростає, можливо, через здатність популяції клітин адаптуватися до підвищеного вмісту катіонів плюмбуму та долати інгібуючу дію його сполук [18].

Більшість пурпурових сіркобактерій є облігатними анаеробами [4, 5, 23, 29], але є дані про види родини Chromatiaceae, ріст яких можливий за мікроаерофільних умов, що має важливе значення для розвитку та виживання цих мікроорганізмів у середовищах, де часто змінюється кисневий режим [16]. Стійкість різних представників аеробних та анаеробних бактерій до продуктів відновлення кисню обумовлена розвитком у цих мікроорганізмів специфічної системи антиоксидантного захисту. Механізми стійкості аноксигенних фототрофних сіркобактерій до молекулярного кисню та система антиок­сидантного захисту цих бактерій досліджені недостатньо [7, 9].

Бактерії C. okenii характеризуються каталазною та супероксиддисмутазною акти­вністю [2, 9, 27, 28]. Тому цікаво було дослідити швидкість поглинання кисню даними бактеріями під час росту в середовищі з різними концентраціями Pb2+ у темряві за наяв­ності органічних сполук. Проби для визначення швидкості поглинання кисню відбирали на шосту добу росту. Результати досліджень представлені на рис. 2.

2 я

о

Я

Я

я я и Я 4'

-Ї-

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Концентрації Pb +, мМ

Рис. 2. Швидкість поглинання кисню клітинами бактерій Chromatium okenii за різних концентра­цій Pb2+.

При культивуванні бактерій без іонів плюмбуму (контроль) швидкість поглинан­ня кисню клітинами є найбільшою та становить 7,44±0,50 нг ат.О/хв-мг клітин. Внесен­ня 1,0 мМ іонів плюмбуму призводить до зменшення швидкості поглинання кисню клі­тинами C. okenii - 2,84±0,44 нг ат.О/хв-мг клітин. Підвищення концентрації Pb2+ до 1,5 мМ уповільнює процес поглинання кисню сіркобактеріями на 83,71%. Подальше збіль­шення концентрації цього металу у середовищі до 2,5 мМ підтримує швидкість погли­нання кисню на рівні 0,92±0,18 нг ат. О/хв-мг клітин.

Проведено аналіз спектрів поглинання екстрактів клітин пурпурових сіркобакте­рій, вирощених у середовищі Ван Ніля з різними концентраціями іонів плюмбуму. У розчині екстрагованих пігментів основні максимуми поглинання пігментів припадають на 363, 435-465, 474, 502-518, 590-600, 670-689, 771 нм (рис. 3). Відомо, що максиму­ми поглинання, які простежуються в довгохвильовій ділянці спектра, зумовлені наявні­стю в клітинах фототрофних сіркових бактерій бактеріохлорофілу а [6, 28], що є фото­синтетично активним пігментом більшості пурпурових сіркобактерій та існує в кількох формах. Різні форми бактеріохлорофілу а перебувають у контакті з білками та ліпідами мембран хроматофорів [8, 25, 27]. Каротиноїди поглинають світло у видимій та інфра­червоній ділянках спектра [14, 15, 17], максимум їх поглинання перебуває у межах 400­600 нм [9, 22]. Склад цих пігментів у клітинах фототрофних бактерій може значно змінюватися залежно від умов культивування [6, 8].

Як видно з рис. 3, під час росту в середовищі з важкими металами відбувається незначний зсув спектрів поглинання. Ймовірно, важкі метали, зокрема Pb2+, викликають зміни конформації молекул пігментів з подальшою їх модифікацією. Отже, збільшення концентрації іонів плюмбуму змінює абсорбційні спектри пігментів C. okenii.

Хроматографічне розділення екстрактів клітин дало змогу виявити пігменти, різ-

І. Кушкевич, С. Гнатуш, С. Гудзь та ін.

 

І

- К

2

- 0,5 мМ

3

-1,0 мМ

4

- 1,5 мМ

S

- 2,0 мМ

6

- 2,5 мМ

850

Рис. 3. Спектри поглинання пігментів C. okenii, вирощених за різних концентрацій Pb2+.

ні за забарвленням та величиною Rf [24, 25, 27]. Зазначимо, що на хроматограмах пере­важають яскраво-зелені, рожево-пурпурові зони.

Дослідження спектрів поглинання та хроматографічне розділення дозволили іде­нтифікувати пігменти і визначити їх вміст у клітинах бактерій C. okenii, вирощених при різних концентраціях іонів плюмбуму. Екстракти клітин містили бактеріохлорофіл а та каротиноїд окенон.

Під час росту без внесення у середовище Ван Ніля солей плюмбуму бактерії C. okenii містили бактеріохлорофіл а в кількості 0,41±0,01 мг/г сухої маси клітин (рис. 4 A).

Таблиця 1

Хроматографічна характеристика пігментного складу бактерій C. okenii

Назва пігменту

Колір пігменту

Спектри поглинання, X, нм

Значення Rf

Бактеріохлорофіл а Окенон

Яскраво-зелений Рожево-пурпуровий

363, 590-600, 670-689, 771 435-465, 474, 502-518

0,17 0,70

Внесення іонів плюмбуму в концентрації 0,5 мМ у середовище призводило до зменшення вмісту цього пігменту в клітинах до 0,35±0,02 мг/г сухої маси клітин. При концентрації 1,0 мМ вміст бактеріохлорофілу а в клітинах був майже вдвічі меншим, порівняно з кон­тролем (рис. 4 A). При подальшому зростанні концентрації Pb2+ у середовищі спостеріга­лося зменшення вмісту пігменту у клітинах. При вирощуванні культури C. okenii у сере­довищі з найвищою концентрацією плюмбуму (2,5 мМ) кількість бактеріохлорофілу а була найменшою та дорівнювала 0,09±0,02 мг/г сухої маси клітин (рис. 4 A).

Вміст окенону в клітинах, вирощених у середовищі без Pb2+, становив 0,91±0,02 мг/г сухої маси клітин. При додаванні 0,5 мМ плюмбуму в середовище спостерігали зменшення кількості даного пігменту в клітинах (рис. 4 Б). З підвищенням концентрації плюмбуму вміст окенону значно зменшувався. При концентрації Pb2+ 2,5 мМ відмічено найменшу кількість окенону (0,71±0,01 мг/г сухої маси клітин).

Очевидно, що процес синтезу пігментів пурпурових сіркових бактерій C. okenii є чутливим до впливу іонів плюмбуму, які виявляють інгібуючу дію.

Як видно з рис. 5.1, клітини C. okenii є паличкоподібними (прямими або злегка зігнутими), овальними із заокругленими кінцями. Діаметр становить 1-6 мкм при дов­жині 1,5-1,6 мкм. У присутності сульфіду на світлі в клітинах з'являються глобули сір­ки (С). Суспензії клітин мають коричневе або пурпурово-червоне забарвлення. На елек-тронномікроскопічних фотографіях спостерігали внутрішньоцитоплазматичні мембран­ні системи везикулярного типу.

Внесення солей плюмбуму в концентраціях 0,5-2,5 мМ (рис. 5.2) призводить до порушень при поділі клітин, змінює їх форму, спричиняє появу клітин великих розмі­рів, зміну внутрішньоцитоплазматичних структур, клітини набувають не характерних форм.

Імовірно, бактерії C. okenii акумулюють метал, відкладаючи його на поверхні клітини за рахунок утворення комплексу з білками клітинної мембрани. Крім того, іони металу нагромаджуються всередині клітин [21]. Очевидно, плюмбум нагромаджується у результаті надходження через транспортні системи. Після проникнення всередину клі-

0,4

0,3

0,2

0,1

0,5     1,0     1,5     2,0 2,5 Концентрації Pb2+, мМ

А

0,9

0,8

0,7

0,1

0,5      1,0      1,5     2,0 2,5 Концентрації Pb2+, мМ

Б

Рис. 4. Вміст пігментів у клітинах бактерій C. okenii під час росту з різними концентраціями Pb2+: A - бактеріохлорофіл а; Б - окенон.

0

0

0

0

Рис. 5.1. Клітини бактерій C. okenii під час росту в середовищі без додаткового внесення Pb+ (х8 000).

Рис. 5.2. Клітини C. okenii при рості в сере­довищі з різними концентраціями Pb2+: A - 0,5 мМ; Б - 1,0 мМ; В -1,5 мМ; Г - 2,0 мМ; Д - 2,5 мМ (х6000).тини відбувається його зв'язування з білками цитоплазми та внутрішньоклітинними структурами або утворення нерозчинних продуктів [20].

1. AeaKHH 3. A. Токсичность тяжелых металлов для микроорганизмов // Микробиоло­гия. 1973. Т. 2. С. 5-46.

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

І Кушкевич - Акумуляція іонів важких металів клітинами chlorobium limicola 1mb k-8 та їхні цитоморфологічні зміни за впливу кадмій сульфату

І Кушкевич - Вплив різних концентрацій pb2+ на фізіолого-біохімічні властивості фототрофних сіркобактерій chromatium okenii