Н Кияк - Вплив свинцю на стан прооксидантно-антиоксидантної рівноваги у пагонах водного моху - страница 1

Страницы:
1  2 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF LVIV UNIV.

Серія біологічна. 2009. Вип. 50. С. 157-163    Biology series. 2009. Is. 50. P. 157-163

УДК 582.32:54.06

ВПЛИВ СВИНЦЮ НА СТАН ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНОЇ РІВНОВАГИ У ПАГОНАХ ВОДНОГО МОХУ FONTINALIS ANTIPYRETICA HEDW.

Н. Кияк*, І. Микієвич**

*Інститут екології Карпат НАН України вул. Стефаника, 11, Львів 79000, Україна е-mail: morphogenesis@mail.lviv.ua **Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського, 4, Львів 79005, Україна e-mail: biofr@franko.lviv.ua

Досліджували вплив свинцю на динаміку ліпопероксидації та актив­ності супероксиддисмутази у пагонах водного моху Fontinalis antipyretica Hedw. Встановлено, що на початкових етапах свинцевого стресу відбува­лося зміщення рівноваги у системі прооксиданти<->антиоксиданти у напря­мі активації пероксидного окиснення. 30- та 60-хвилинні експозиції з важ­ким металом індукували підвищення активності СОД. Виявлено кількісні зміни в електрофоретичному спектрі СОД за дії свинцю.

Ключові слова: Fontinalis antipyretica, свинець, дієнові кон'югати, МДА, супероксиддисмутаза.

У рослинному організмі одним із можливих компонентів швидкої реакції на стрес є активація пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ). ПОЛ у клітині підтримується на постійному рівні завдяки існуванню багаторівневої антиоксидантної захисної систе­ми. Тому збалансованість між обома частинами цієї системи - пероксидним окисненням з одного боку й антиоксидантною активністю з іншого - є важливою умовою для збере­ження нормальної життєдіяльності клітини. Вважається, що зміщення прооксидантно-антиоксидантної рівноваги є однією з перших неспецифічних ланок у розвитку стрес-реакції та може слугувати, згідно з В. А. Барабой [1], тією біологічно важливою зміною внутрішнього середовища рослинної клітини, яка запускає інші механізми захисту.

Значною кількістю робіт продемонстровано, що загальною реакцією-відповіддю рослин на дію таких важких металів, як свинець, кадмій, мідь, цинк і хром, є посилене утворення та нагромадження активних форм кисню (АФК) й активація процесів ПОЛ [22]. Реакція мохів на дію важких металів висвітлена у багатьох публікаціях [21, 25]. Специфіка їх анатомо-морфологічної структури та здатність поглинати й акумулювати високі концентрації іонів важких металів стали передумовою для використання цих рослин як біоіндикаторів забруднення атмосферного і водного середовищ, а також як модельних об' єктів для дослідження морфофізіологічних і геномних змін, спричинених дією важких металів [12, 24].

Механізми оксидного стресу, індукованого важкими металами, досить докладно вивчені на прикладі квіткових рослин [8, 16] і значно слабше - на прикладі мохів [23]. Тому, метою роботи було дослідження динаміки процесу ПОЛ і антиоксидантного за­хисту у пагонах водного моху Fontinalis antipyretica Hedw. як можливих факторів пер­винної реакції рослинного організму на дію стресу, спричиненого свинцем.

Об' єктом дослідження були рослини водного моху Fontinalis antipyretica. Для аналізу використовували пагони, вирощені в лабораторній культурі у контрольованих

© Кияк Н., Микієвич І., 2009умовах температури (20-22°С), вологості (85-90%) та освітлення (2500 лк) [4]. Обробку свинцем здійснювали шляхом внесення рослинного матеріалу у водне поживне середо­вище Кноп-II, що містило ацетат свинцю у концентраціях 1,0; 10,0 та 100,0 мкмоль/л. Тривалість експозиції - 15, 30, 60 хв та 48 год. Контролем були рослини, які не обробля­ли розчином важкого металу.

Пероксидне окиснення ліпідів оцінювали за вмістом первинних продуктів - дієно-вих кон' югатів (ДК) і кінцевого продукту ліпопероксидації - малонового диальдегіду (МДА). Для визначення кількості дієнових кон' югатів наважку рослинного матеріалу го­могенізували в 0,1 М калій-фосфатному буфері (рН 7,0), додавали суміш гептан-ізопропанол (1:1) та екстрагували пртягом 20 хв. Вміст ДК визначали спектрофотометри­чно у гептановому шарі за довжини хвилі 232 нм та виражали в одиницях абсорбції [3].

Для визначення концентрації МДА рослинний матеріал гомогенізували у 20% розчині трихлороцтвої кислоти й інкубували з 0,5% розчином тіобарбітурової кислоти. Вміст МДА визначали спектрофотометричним методом за довжини хвилі 532 нм і вира­жали в нМ на 1 г сирої маси [9].

Для визначення активності супероксиддисмутази (СОД) рослинний матеріал гомогенізували в 0,15 М фосфатному буфері (рН 7,8) й екстрагували протягом 30 хв при кімнатній температурі. Супернатант, отриманий після центрифугування (10 хв, 5000 g), додавали до інкубаційного середовища, що містило 0,33 мМ ЕДТА, 0,4 мМ нітросиній тетразолій, 0,01 мМ феназинметсульфат та 0,8 мМ НАДФН. Оптичну густину розчину вимірювали спектрофотометрично за довжини хвилі 540 нм. Активність СОД виражали в умовних одиницях на мг білка за хв [11].

Концентрацію білка визначали за методом Бредфорда [14].

Електрофоретичний аналіз рослинних зразків здійснювали на поліакриламідному гелі з використанням диск-електрофорезу [25]. Для виявлення супероксиддисмутази застосовували інкубаційне середовище з нітросинім тетразолієм [6].

Досліди проводили у трьох повторностях. Одержані результати вважали статис­тично ймовірними, якщо р<0,05. Побудову графіків здійснювали за допомогою прикла­дної програми „Microsoft Exel 2000".

У пагонах F. antipyretica, які інкубували протягом 48 год у розчинах ацетату сви­нцю, визначали вміст продуктів ПОЛ. Встановлено, що зі зростанням стресового впли­ву свинцю відбувалося підвищення вмісту первинних продуктів ліпопероксидації - діє-нових кон' югатів (ДК). Так, їх кількість у пагонах водного моху під впливом 10,0 та 100,0 мкмоль/л ацетату свинцю зростала в 1,2-1,5 рази порівняно з контролем (табл. 1). Відомо, що підвищення рівня ДК у клітинах є чутливим тестом на появу гідроперекисів і, відповідно, на активацію ПОЛ [8]. Отримані дані узгоджуються з визначеним рівнем одного з кінцевих продуктів ПОЛ - малонового диальдегіду (МДА), кількість якого теж зростала у рослинному матеріалі під впливом свинцю (табл. 1).

Отже, свинцевий стрес індукує зростання процесу ПОЛ у пагонах водного моху F. antipyretica, свідченням чого є суттєве підвищення вмісту дієнових кон' югатів і МДА. Ці зміни, очевидно, можуть слугувати пусковим механізмом для відповідних за­хисних систем. У наших дослідженнях показано, що у результаті 48-годинної експозиції пагонів фонтіналіса у розчинах з оцтовокислим свинцем активність супероксиддисмута-зи (ферменту, котрий утилізує О2 - та перешкоджає ініціації ПОЛ) підвищувалася на 25­30% (табл. 2). Збільшення активності ферменту могло бути обумовлене активацією його латентних форм і (або) синтезом нових молекул ферменту [2]. Із літературних джерел

Таблиця 1

Вплив ацетату свинцю на вміст продуктів ПОЛ у пагонах F. antipyretica

Концентрації ацетату свинцю

Вміст дієнових кон'югатів, од. абсорб./мл

Вміст МДА, нмоль/г маси сирої речовини

Контроль (без металу)

12,8±0,6

31,3±1,2

1,0 мкмоль/л

13,2±1,4

33,9±0,9

10,0 мкмоль/л

17,4±0,8*

41,7±0,8*

100,0 мкмоль/л

18,9±1,1*

44,5±1,3*

Примітка. * - різниця порівняно з контролем статистично достовірна при p<0,05.

відомо, що в рослинних клітинах присутні 3 типи СОД: Cu/Zn-СОД, Mn-СОД та Fe-СОД [13]. Експресія генів СОД є чутливою до редокс-стану клітини, тому підвищення вмісту активних форм кисню в умовах оксидного стресу є сигналом до її активації [18]. У нашій роботі було досліджено вплив ацетату свинцю на електрофоретичний спектр множинних молекулярних форм супероксиддисмутази у пагонах F. antipyretica. Як вид­но на рис. 1, електрофореграма СОД представлена трьома фракціями з молекулярними масами 33, 40 та 49 кДа. Експозиція рослинного матеріалу у середовищі з ацетатом сви­нцю призвела до кількісних змін у спектрі СОД. Із підвищенням концентрації важкого металу спостерігалося послаблення фракції з молекулярною масою 33 кДа та суттєве посилення інтенсивності фракції з молекулярною масою 49 кДа порівняно з контролем. Очевидно, це може свідчити про існування координації експресії різних видів СОД. Аналогічно було показано, що у рослинах з надекспресією Fe-СОД експресія цитозоль-ної та хлоропластної Cu/Zn-СОД була пригніченою [27].

Отже, результати наших експериментів дають змогу говорити про те, що у паго­нах F. antipyretica в умовах стресового впливу, індукованого свинцем, відбувається ак­тивація СОД. Відомо, що у разі досить інтенсивного стресу може включатися синтез

Мол. маса,

кДа

66 -

45-

29-

М 1 2 3 4

Рис. 1. Вплив ацетату свинцю на електрофоретичний спектр супероксиддисмутази у пагонах вод­ного моху F. antipyretica: М - маркер молекулярних мас; 1 - контроль; 2 - 1,0 мкмоль/л ацетату свинцю; 3 - 10,0 мкмоль/л; 4 - 100,0 мкмоль/л.нових мРНК та молекул СОД. Так, одночасне збільшення активності СОД і кількості відповідних білків було відзначено в умовах сольового стресу в хлоропластах гороху [17], у листках толерантного сорту Lycopersion pennelii [19], у хлоропластах пшениці під впливом міді [20]. Іншими словами, в кожному конкретному випадку активність ферменту регулюється відповідно до метаболічних потреб клітин, які залежать від інте­нсивності стресового впливу, його тривалості та чутливості рослин.

Виходячи з того, що 48-годинна дія свинцю впливає на зміщення прооксидантно-антиоксидантної рівноваги у пагонах водного моху, ми дослідили динаміку процесу ПОЛ і активності супероксиддисмутази на ранніх етапах впливу важкого металу - в умовах коротких (15, 30 і 60 хв.) експозицій. Установлено, що короткотривала 15-хвилинна обробка пагонів F. antipyretica розчином ацетату свинцю в концентрації 1,0­100,0 мкмоль/л призводила до зростання вмісту початкових продуктів ПОЛ - дієнових кон'югатів у 1,5 рази з поступовим їх зниженням при тривалій експозиції (рис. 2, А).

Вміст малонового диальдегіду у зразках залежав як від тривалості експозиції зі свинцем, так і від концентрації важкого металу. 15-хвилинна експозиція рослинного матеріалу у розчині ацетату свинцю практично не впливала на вміст цієї сполуки, і ли­ше обробка металом тривалістю 30 і 60 хв у концентраціях 10,0-100,0 мкмоль/л індуку­вала зростання вмісту МДА (рис. 2, Б).

Активність СОД теж суттєво залежала від тривалості свинцевого стресу. У перші хвилини реакції активність ферменту не перевищувала контрольного варіанту, після 30-хвилинної експозиції у розчині з ацетатом свинцю активність зростала на 20%, а макси­мум активності СОД було відзначено після 1-годинної експозиції з металом - на 40% вище активності контрольного варіанту (табл. 2).

А

Б

-

о =

и СО 90 80 70 60 50 40 30 20 10

0

□ 15 хв □ 30 хв □ 60 хв

я

-

2

о

я ю в.

о и

IS

о

20 18 16 14 12 10

і-□ 15 хв □ 30 хв □ 60 хв -1

 

Ї

 

 

 

 

ь

 

Г

ъ

 

 

 

 

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

і±

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Г

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

г

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

г

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

г

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 г~

 

 

 

 

_

 

 

 

 

контр.

1,0

10,0 100,0

контр.

1,0

10,0 100,0

Рис. 2. Вплив ацетату свинцю на динаміку вмісту продуктів ПОЛ у пагонах F. antipyretica: А - дієнові кон'югати; Б - малоновий диальдегід. 1,0-100,0 - концентрації ацетату свинцю (мкмоль/л); контр. - контроль (без металу). 15 хв, 30 хв, 60 хв - тривалість реакції зі свинцем.

8

6

4

2

0

Таблиця 2

Вплив ацетату свинцю на динаміку активності супероксиддисмутази у пагонах F. antipyretica

_Активність СОД, відн. од./ мг білка/ хв_

15 хв реакції 30 хв реакції 60 хв реакції   48 год реакції

Концентрації ацетату

свинцю, кмоль/л_________

Контроль (без металу)        191,2±8,6       195,4±5,5       193,7±4,5 236,3±6,2 1,0 112,5±5,8*      192,7±9,8       218,9±7,2 247,6±7,5

10,0 158,7±11,8*    238,3±7,8*    271,8±10,2* 313,5±6,8*

100,0 188,5±8,1     230,2±10,2*    267,5±7,5* 293,2±5,1*

Примітка. * - різниця порівняно з контролем статистично достовірна при p<0,05.

Отже, обговорюючи результати наших досліджень, слід зауважити, що пероксид-не окиснення й антиоксидантний потенціал у пагонах F. antipyretica змінюються в часі. 15-хвилинна дія оцтовокислого свинцю на рослини призводила до суттєвого зростання первинних продуктів ПОЛ. Концентрація МДА й активність супероксиддисмутази збе­рігалися на рівні контрольного варіанту. 30- та 60-хвилинні експозиції з важким мета­лом індукували зворотний процес: зниження вмісту первинних продуктів ПОЛ, зростан­ня концентрації кінцевого продукту - МДА та суттєве підвищення активності СОД. Подібні результати щодо перебігу ПОЛ і стану антиоксидантної системи були встанов­лені у хлоропластах гороху в умовах теплового стресу [7], в умовах надмірного зволо­ження та водного дефіциту в пагонах ячменю [5].

Таким чином, результати наших досліджень свідчать про індукцію оксидного стресу в умовах токсичного впливу свинцю у пагонах F. antipyretica. Активація ПОЛ на початкових етапах свинцевого стресу слугує підтвердженням можливої ролі продуктів ліпопероксидації як медіаторів стресу в рослинах. Зворотне зміщення прооксидантно-антиоксидантної рівноваги, виявлене у наших дослідах, очевидно, є важливою ланкою в процесі формування адаптивних реакцій рослини на свинцевий стрес.

1. Барабой В. А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов // Успехи со­временной биологии. 1991. Т. 11. Вып. 6. С. 923-932.

2. Бараненко В. В. Супероксиддисмутаза в клетках растений // Цитология. 2006. Т. 48. № 6. С. 465-474.

3. Гаврилов В. Б., Мишкорудная М. И. Спектрофотометрическое определение содер­жания диеновых гидроперекисей липидов в плазме крови // Лаб. дело. 1983. № 3.

С. 33-35.

4. Демкив О. Т., СытникК. М. Морфогенез архегониат. К.: Наук. думка, 1985. 204 с.

5. Калашников Ю. Е., Балахнина Т. И., Закржевский Д. А. Действие почвенной гипок­сии на активацию кислорода и систему защиты от окислительной деструкции в корнях и листьях ячменя // Физиол. раст. 1994. Т. 41. № 4. С. 583-588.

6. Корочкин Л. И., Серов О. Л., Пудовкин А. И. и др. Генетика изоферментов. М.: Нау­ка, 1977. 275 с.

7. Курганова Л. Н., Веселов А. П., Гончарова Т. А., Синицына Ю. В. Перекисное окис­ление липидов и антиоксидантная система защиты хлоропластов гороха при тепло­вом шоке // Физиология растений. 1997. Т. 44. № 5. С. 725-730.

8. Мерзляк М. Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки // Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. М.: ВИ­НИТИ, 1989. 167 с.

9. Мусиенко М. М., Паршикова Т. В., Славный П. С. Спектрофотометрические методы в практике физиологии, биохимии и экологии растений. К.: Фитосоциоцентр, 2001.

200 с.

10. Пескин А. В., Столяров С. Д. Окислительный стресс как критерий оценки окружа­ющей среды // Изв. АН СССР. Сер. Биол. 1994. С. 588-595.

11. Чвари С., Андял Т., Штренгер Я. Определение антиоксидантньгх параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте // Лаб. дело. 1991. № 3. С. 95-99.

12. Bargagli R. Mosses as passive and active biomonitors of trace elements // Trace Elements in Terrestrial Plants. / Ed. Bargagli R. - Springer-Verlag, Berlin. 1998. P. 207-236.

13. Bowler С., Van Camp W., Van Montagu M., Inze D. Superoxide dismutase in plants // Crit. Rew. Plant Sci. 1994. Vol. 13. P. 199-218.

14. Bredford W. A simple method for protein test // Annal. Biochem. 1976. Vol. 72.

P. 248-252.

15. Choudhury S., Panda S. K. Induction of oxidative stress and ultrastructural changes in moss Taxithelium nepalense (Schwaegr.) Broth. under lead (Pb) and arsenic (As) phyto-toxicity // Curr. Sci. 2004a. Vol. 87. P. 342-348.

16. Gille G., Sigler K. Oxidative stress and living cells // Folia Microbiol. 1995. Vol. 40. P. 131-152.

17. Gomez J., Jimenez A., Olmos E., Sevilla F. Location and effects of long-term NaCl stress on superoxide dismitase and ascorbate peroxidase isoenzymes of pea (Pisum sativum, cv. Puget) chloroplasts // J. Exp. Bot. 2003/4. Vol. 55. P. 119-130.

18. Herbette S., Lene C., de Iabrouhe D., Drevet J., Roeckel-Drevet P. Transcripts of sun­flower antioxidant scavengers of the SOD and GPX families accumulate differentially in response to downy mildew infection, phytohormones, reactive oxygen species, nitric oxide, protein kinase and phosphatase inhibitors // Physiol. Plant. 2003. Vol. 119. P. 418-428.

19. Mittova V., Tal M., Volokita M., Guy M. Up-regulation of the leaf mitochondrial and perox-isomal antioxidative systems in response to salt-induced oxidative stress in the wild salt-tolerant tomato species Lycopersicon pennellii // Plant. Cell Envir. 2003. Vol. 26. P. 845-856.

20. Navari-Izzo F., Milone M. T. A., Quartacci M. F. et al. Metabolic changes in wheat plant subjected to a water-deficit stress programme // Plant Sci. 1993. Vol. 92. P. 151-157.

21. Panda S. K. Heavy metal phototoxicity induces oxidative stress in a moss, Taxithelium sp. // Curr. Sci. 2003. Vol. 84. P. 631-663.

22. Panda S. K., Choudhury I., Khan M. H. Heavy metal induced lipid peroxidation affects antioxidants in wheat leaves // Biol. Plant. 2003. Vol. 46. P. 289-294.

23. Saxena A., Saxena D.K., Srivastava H. S. The influence of glutathione on physiological effects of lead and its accumulation in moss Sphagnum squarrosum // Water Air Soil Pollut. 2003. Vol. 143. P. 351-361.

24. Sidhu M., Brown D. H. A new laboratory technique for studying the effect of heavy met­als on bryophyte growth // Ann. Bot. 1996. Vol. 78. P. 711-717.

25. Taylor P. Analysis of moss dehydrogenases by polyacrylamide disco-electrophoresis // Can. J. Bot. 1070. Vol. 48. P. 367-369.

26. Tyler G. Bryophytes and heavy metals: a literature review // Bot. J. Linn. Soc. 1990. Vol. 104. P. 231-253.

27. Van Camp W., Herouart D., Willekens H. et al. Tissue-specific activity of two manga­nese superoxide dismutase promoters in transgenic tobacco // Plant Physiol. 1996b. Vol. 112. P. 525-535.

INFLUENCE OF LEAD ON THE STATE OF PROOXIDATIVE-ANTIOXIDATIVE EQUILIBRIUM IN THE SHOOTS OF AQUATIC MOSS FONTINALIS ANTIPYRETICA HEDW.

N. Kyjak*, I. Mykiyevych**

**Institute of Ecology of the Carpathians of NAS of Ukraine 11, Stefanyk St., Lviv 79000, Ukraine e-mail: morphogenesis@mail.lviv.ua **Ivan Franko National University of Lviv 4, Hrushevskyi St., Lviv 79005, Ukraine e-mail: biofr@franko.lviv.ua

The influence of lead on dynamics of lipid peroxidation and activity of superoxide dismutase in shoots of aquatic moss Fontinalis antipyretica Hedw. was investigated. It was fixed activation of lipid peroxidation on the initial stages of lead stress. 30- and 60-minute expositions with heavy metal induced increasing of superoxide dismutase activity. The quantitative changes in the electrophoretic spectrum of SOD under lead influence were revealed.

Key words: Fontinalis antipyretica, lead, diene conjugates, malonoic dialdehide, superoxide dismutase.

ВЛИЯНИЕ СВИНЦА НА СОСТОЯНИЕ ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНОГО РАВНОВЕСИЯ В ПОБЕГАХ ВОДНОГО МХА FONTINALIS ANTIPYRETICA HEDW.

Н. Кияк*, И. Микиевич**

*Институт экологии Карпат НАН Украины ул. Стефаника, 11, Львов 79000, Украина е-mail: morphogenesis@mail.lviv.ua **Львовский национальный университет имени Ивана Франко ул. Грушевского, 4, Львов 79005, Украина e-mail: biofr@franko.lviv.ua

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

Н Кияк - Вплив абіотичних стресових факторів на інтенсивність пол і активність супероксиддисмутази у пагонах водного моху

Н Кияк - Вплив свинцю на стан прооксидантно-антиоксидантної рівноваги у пагонах водного моху

Н Кияк - Роль бріофітного покриву у ренатуралізації техногенних субстратів на території видобутку сірки

Н Кияк - Фотосинтетична активність мохів на девастованих територіях видобутку сірки