О Аравіцька - Вплив ультрафіолетового опромінення на антибіотичну активність продуцента сіоміцину - страница 1

Страницы:
1  2 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF LVIV UNIV.

Серія біологічна. 2009. Вип. 50. С. 11-17 Biology series. 2009. Is. 50. P. 11-17

УДК 567.809.55

ВПЛИВ УЛЬТРАФІОЛЕТОВОГО ОПРОМІНЕННЯ НА АНТИБІОТИЧНУ АКТИВНІСТЬ ПРОДУЦЕНТА СІОМІЦИНУ STREPTOMYCES SIOYAENSIS LV81

О. Аравіцька, Я. Грубський, М. Мироновський, О. Миколаїв, О. Громико, Б. Осташ, В. Федоренко

Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського, 4, Львів 79005, Україна e-mail: v_fedorenko@franko.lviv.ua

Вивчено мінливість штаму Streptomyces sioyaensis Lv81 за рівнем синтезу тіопептидного антибіотика сіоміцину при вирощуванні на повно­цінних живильних середовищах. Найвищу антибіотичну активність він має на соєвому середовищі. Досліджено вплив ультрафіолетового опромінення на виживання спор і антибіотичну активність штаму S. sioyaensis Lv81. Опромінення ультрафіолетом у дозі, що викликає падіння виживання спор до 0,2%, ефективне для відбору мутантів з підвищеним синтезом сіоміци­ну. Для порівняльного аналізу рівня біосинтезу сіоміцину вихідним шта­мом і його мутантами, а також пошуку клонів з підвищеною продукцією цього антибіотика доцільно використовувати метод, що ґрунтується на стимулюванні сіоміцином росту на середовищі з канаміцином штаму Streptomyces lividans ТК24, який містить плазміду pMO16 з геном канамі-цин- і неоміцин-стійкості neo під контролем tip^-промотора.

Ключові слова: Streptomyces sioyaensis, сіоміцин, тіопептидні антибіотики, ультрафіолетове опромінення.

Штам Streptomyces sioyaensis Lv81(=NRRL-B5408) продукує комплекс тіопептид-них антибіотиків, головним із яких є сіоміцин А. Сіоміцин і найближчий до нього за структурою тіострептон володіють низкою дуже важливих біологічних активностей. Вони блокують білковий синтез у бактерій, зв'язуючись із комплексом рибосомного білка L11 і 23S рРНК. Крім того, вони діють як імуносупресанти і протипухлинні аген­ти, а також здатні пригнічувати розвиток збудника малярії Plasmodium falciparum [3, 5, 9, 12]. Хоча тіопептиди відкриті ще у 50-х роках ХХ ст., вони мали тільки обмежене застосування у ветеринарній медицині, що спричинене головно їхньою низькою розчинністю у воді.

Зростаюча потреба у нових антибактерійних і протипухлинних агентах, зумовле­на насамперед розповсюдженням резистентності збудників інфекцій і ракових клітин до широковживаних антибіотиків, знову привертає велику увагу дослідників до тіопепти-дів, зокрема до тіострептону і сіоміцину. Однак механізм біосинтезу цих антибіотиків, його генетичний контроль, а також генетичні особливості актиноміцетів, які їх продуку­ють, вивчені недостатньо. Лише нещодавно клоновано кластери генів біосинтезу цих антибіотиків і доведено, що їхній пептидний попередник синтезується на рибосомах, і зроблено перші кроки у напрямі створення ефективної системи клонування генів у S. sioyaensis [8, 10]. Для з'ясування генетичного контролю біосинтезу сіоміцину та отри­мання його біотехнологічних продуцентів треба опрацювати систему селекції мутантів S. sioyaensis. Штами актиноміцетів дикого типу зазвичай синтезують дуже незначні кі­лькості антибіотичних сполук, тому необхідно проводити відбір клонів із підвищеним рівнем синтезу антибіотика. Це завдання є актуальним і для S. sioyaensis.

© Аравіцька О., Грубський Я., Мироновський М. та ін., 2009

Метою нашої роботи є опрацювання системи селекції мутантів S. sioyaensis зі зміненою здатністю до біосинтезу SiA з використанням як мутагену ультрафіолетового випромінювання (УФ). Для виконання цього завдання ми дослідили спонтанну мінли­вість S. sioyaensis за рівнем антибіотичної активності на різних поживних середовищах і вивчили вплив УФ на виживання спор штаму та біосинтез сігоміцину.

У роботі використано штами S. sioyaensis Lv81(=NRRL-B5408), S. globisporus 1912-2 (продуцент ландоміцину Е) та S. nogalater IMET 43360 (продуцент ногаламіци-ну) з Колекції культур мікроорганізмів - продуцентів антибіотиків ЛНУ імені Івана Франка, та похідні S. sioyaensis, отримані у цій роботі. Як тест-культури для визначення антибіотичної активності S. sioyaensis використали штами Sarcina lutea та Bаcillus ce-reus. Для аналізу біосинтезу сіоміцину використали також штам Streptomyces lividans ТК24, який містить плазміду pMO16.

Штами S. sioyaensis вирощували при температурі 28°С на таких середовищах: вівсяному (ВС; овес мелений - 40 г, кукурудзяне борошно - 20 г , NaCl - 5 г, глюкоза -10 г, агар - 15 г, вода водопровідна - до 1 л); соєвому №14 (СС-14; соєве борошно - 20 г, NaCl - 5 г, глюкоза - 10 г, агар - 15 г, вода водопровідна - до 1 л); кукурудзяному №7 (КС-7; кукурудзяне борошно - 20 г, NaCl - 5 г, глюкоза - 10 г, агар - 15 г, вода водопро­відна - до 1 л); середовищі Беннета (пептон - 1 г, дріжджовий екстракт - 1 г, триптон -2 г, глюкоза 10 г, агар - 20 г, вода дистильована - до 1 л). Штам Streptomyces lividans ТК24 (pMO16) вирощували при температурі 28°С на ВС, а Sarcina lutea та Bаcillus cer-eus на триптозному агарі [7] при температурі 37°С.

Антибіотичну активність штаму S. sioyaensis визначали методом дифузії в агар за пригніченням росту тест-культур [2]. Визначали індекси продуктивності (ІП) окремих клонів культури [11].

Для порівняльного аналізу рівня біосинтезу сіоміцину вихідним штамом та його мутантами застосували також тест-систему S. lividans ТК24 (pMO16). Для визначення антибіотичної активності з використанням цієї системи штами S. sioyaensis вирощували в середовищі SG [7] протягом 7 діб при температурі 28°С. Сіоміцини екстрагували з 2 мл культури. Її центрифугували 1 хв при 13000 об/хв, супернатант зливали, осад двічі промивали дистильованою водою та осад ресуспендували в 300 мкл диметилсульфокси-ду (тривалість екстракції 90 хв). Екстракти центрифугували 1 хв при 13000 об/хв. На паперові диски наносили по 10 мкл екстракту, а також розчинника (контроль). Диски сушили 60 хв при температурі 37°С та накладали на поверхню середовища з канаміци-ном (50 мкг/мл), попередньо засіяного газоном S. lividans ТК24 pMO16. Чашки інкубу-вали протягом трьох діб при 28°С та вимірювали зони росту S. lividans ТК24 (pMO16) навколо дисків з екстрактами. При цьому враховували вагу біомаси S. sioyaensis, з якої проводили екстракцію сіоміцину.

Тонкошарову хроматографію (ТШХ) екстрактів, отриманих з біомаси S. sioyaensis, проводили в системі розчинників хлороформ:метанол (10:1) на пластинках Silufol. Після проведення ТШХ пластинки заливали 0,7% агаризованим середовищем LB [7] з додаван­ням тест-культур. Пластинки інкубували 12 год при 28°С. Зони пригнічення росту тест-культур навколо ділянок хроматограми зі сіоміцином спостерігали у видимому світлі.

Спори штаму S. sioyaensis опромінювали ультрафіолетовими променями (УФ-променями) з довжиною хвилі 260-280 нм. Джерелом УФ-променів служила лампа Medicor BLM-12. Потужність лампи - 15 Вт, віддаль від лампи до поверхні суспензії спор - 16 см.

Статистичну обробку даних проводили за допомогою програми Origin50.

Для кількісного визначення рівня продукції сіоміцину штамом S. sioyaensis підіб­рано оптимальну тест-культуру. Оскільки сіоміцини активні проти грампозитивних бак­терій, то дослідили можливість використання Sarcina lutea та B. cereus для виявлення антибіотичної активності S. sioyaensis. Культура S. lutea була більш чутливою до дії сіоміцину, тому в подальших експериментах саме її використали як тест-культуру.

Відомо, що рівень антибіотичної активності актиноміцетів залежить від складу живильних середовищ, на яких їх вирощують [1, 2]. Підбір середовища, оптимального для росту й антибіотичної активності S. sioyaensis був наступним етапом нашої роботи. Вивчено ріст і антибіотичну активність штаму на чотирьох повноцінних живильних середовищах: ВС, КС-7, СС-14, середовищі Беннета. Не спостерігали суттєвих відмін за нагромадженням біомаси S. sioyaensis на вказаних середовищах, однак для отримання високого титру спор культуру вирощували на ВС. Найвище середнє значення антибіо­тичної активності мали клони, які утворилися на середовищах СС-14 (середній ІП ста­новив 5,30±0,10) і ВС (середній ІП - 4,50±0,08) (табл. 1). Клони, що виросли на середо­вищах ВС, КС-7 і СС-14 більш мінливі за рівнем антибіотичної активності (коефіцієнт варіації CV близько 39%), ніж клони зі середовища Беннета (CV=24,9%). Частка «плюс»-варіантів з рівнем антибіотичної активності, вищим від X +2о, які вважаються найбільш цінними у селекційному сенсі [1], варіювала у межах 4,5-5,8% та була найви­щою серед клонів зі середовища СС-14. Врахувавши отримані дані, а також вартість інгредієнтів живильних середовищ, ми дійшли висновку, що слід надати перевагу сере­довищу СС-14 для використання у подальших експериментах зі селекції S. sioyaensis. Клони, вирощені на ньому, мали найвищий середній рівень антибіотичної активності та відносно високу мінливість за рівнем синтезу сіоміцину. Серед них було й відносно багато «плюс»-варіантів.

Ми дослідили вплив різних доз УФ на життєздатність спор S. sioyaensis та порів­няли його з іншими стрептоміцетами - S. nogalater IMET43360, продуцентом антрацик-лінового антибіотика ногаламіцину та Streptomyces globisporus 1912-2, продуцентом ангуциклінового антибіотика ландоміцину Е, за чутливістю до цього мутагену (рис. 1).

Спори S. sioyaensis опромінювали УФ протягом 10-150 с. Опромінення спор шта­му протягом 10 с спричиняло зниження їх виживання удвічі, а протягом 40 с - більш ніж на 90%. Летальна дія УФ зростала зі збільшенням часу опромінення. Після 90 с опромінення виживало близько 1,3% спор, а після 150 с - 0,03%. Коли дія УФ тривала 10-60 с, то найстійкішим до дії мутагену був S. nogalater. Однак збільшення часу опро­мінення до 90 с і більше знижувало виживання його спор до рівня, властивого S.

Таблиця 1

Антибіотична активність штаму S. sioyaensis Lv81 на різних живильних середовищах

 

Показники

Середовища та їх склад

Кількість

Середнє значен-

Частка «плюс»-

Частка «мінус»-

Коефіцієнт варіації,

CV, %

 

клонів, N

ня ІП, (M±m)

варіантів, %

варіантів, %

 

ВС

343

4,50±0,08

4,5

1,4

39,8

КС-7

348

3,31±0,07

4,6

4,0

39,4

СС-14 Беннет

383 367

5,30±0,10 3,22±0,04

5,8

5,7

2,0 0,3

39,2

24,9

2 1,5 1

0,5 0

-0,5 -1

-1,5 -2

-2,5 Рис. 1.

Залежність виживання спор штамів S. nogalater IMET 43360 (а), S. sioyaensis Lv81 (б) і S. globis-porus 1912-2 (в) від часу УФ-опромінення. За віс­сю абсцис - час опромінення, с; за віссю ординат -lg виживання спор, %.

sioyaensis. Характер кривої S. globisporus свідчить про те, що він значно чутливіший до дії УФ, ніж S. sioyaensis і S. nogalater.

Відомо, що УФ виявляє найбільший мутагенний ефект у дозах, при яких виживання клі­тин становить від 0,1 до 1,0% [1, 4]. Тому при вивченні впливу УФ на антибіотичну активність S. sioyaensis (табл. 2) використа­но час опромінення 90 і 120 с. За цих доз виживання спор штаму становило близько 1,2 та 0,2% відповідно. Опромінення УФ протягом 90 с дещо знижувало середній ІП досліджуваних кло­нів (на 2%). Натомість зростання дози до 120 с зумовило підвищення на 17,3% серед­нього ІП клонів, отриманих з УФ-опромінених спор, порівняно з вихідним штамом. Серед них виявили й найбільше «плюс»-варіантів - 15,3% проти 4,5% у вихідного шта­му. Порівняно з вихідним штамом коефіцієнт варіації за ознакою антибіотичної актив­ності зріс майже на 5% після 120 с опромінення та на 10% після 90 с.

Виділено 40 УФ-індукованих та «плюс»-варіантів (17 після опромінення протя­гом 90 с і 33 - після 120 с). Їх порівняли за ІП з такою ж за чисельністю вибіркою спон­танних «плюс»-варіантів вихідного штаму. Як серед спонтанних, так і серед УФ-індукованих «плюс»-варіантів переважають клони з відносно найнижчими ІП - від 9,8 до 12,0. Їх частка варіює у цих вибірках від 78 до 99%. Серед спонтанних «плюс»-варіантів виявлено 6% таких, що мали відносно найвищі ІП (13,0-16,0). Після УФ-опромінення протягом 120 с (виживання спор 0,2%) отримано значно більше (21%) «плюс»-варіантів з такими ІП. Натомість при меншій дозі УФ (90 с) не вдалося виділити клони з найвищими ІП. Ці дані свідчать про те, що існує досить вузький діапазон доз УФ, за яких слід вести відбір клонів S. sioyaensis Lv81 з підвищеним синтезом сіоміцину.

Досліджено можливість використання у селекції S. sioyaensis тест-системи S. livi-dans ТК24 (pMO16). Ця система ґрунтується на властивості тіопептидних антибіотиків індукувати експресію генів, що перебувають під контролем промотора гена tipA. У при­

Таблиця 2

Вплив УФ-опромінення спор на антибіотичну активність S. sioyaensis Lv81

Час обробки спор, с

Кількість клонів, %

Середнє зна­чення ІП, %

Частка «плюс»-варіантів, %

Частка «мінус»-варіантів, %

Коефіцієнт варіації,

CV, %

Контроль        395             100*                 4,5                   1,4 39,8 90             181          98,0±0,3              9,3                   4,9 49,0 120            215          117,3±0,5             15,3                   0 44,1

Примітка. * - за 100% приймали середнє значення ІП спонтанних клонів штаму S. sioyaensis Lv81.сутності тіопептидів білок ТірАL набуває здатності зв'язуватися з промоторами різних генів, включно з власним, і активувати їхню експресію [6]. Плазміда pMO16 містить ген neo, що забезпечує стійкість до канаміцину та неоміцину, злитий з промотором ptipA. За присутності сіоміцинів у середовищі штам S. lividans ТК24 (pMO16) набуває стійкості до канаміцину і неоміцину та росте на середовищі з цими антибіотиками. Розміри зон росту зростають зі збільшенням кількості тіопептидів в екстрактах, нанесених на диски.

Ми порівняли вихідний штам S. sioyaensis Lv81 та 23 УФ-індукованих «плюс»-варіантів за здатністю пригнічувати ріст тест-культури Sarcina lutea і стимулювати ріст S. lividans ТК24 (pMO16). На диски наносили однакові кількості екстрактів із культур дос­ліджуваних штамів і накладали їх на поверхню середовищ, засіяних газонами Sarcina lutea та S. lividans ТК24 (pMO16). Виявили, що зони пригнічення росту Sarcina lutea на­вколо дисків з екстрактами мутантних штамів на 8-10% ширші, ніж у вихідного штаму. У той же час зони росту S. lividans ТК24 (pMO16) навколо дисків з екстрактами тих самих штамів на 20-40% більші, ніж у вихідного штаму. Це свідчить про те, що метод з викори­станням S. lividans ТК24 (pMO16) для пошуку штамів з підвищеним синтезом сіоміцину має вищу чутливість порівняно із застосуванням методу пригнічення росту тест-культури Sarcina lutea. На рис. 2 наведено приклад порівняння зон стимуляції росту S. lividans ТК24 (pMO16) екстрактами, виділеними з вихідного штаму, та його УФ-індукованого мутанта Suv92. Зона росту тест-штаму навколо диска з екстрактом цього мутанта перевищує таку ж зону росту навколо контрольного диска у середньому на 30% .

Рис. 2. Зони росту S. lividans ТК24 (рМОІб) навко­ло дисків з екстракта­ми УФ-індукованого мутанта Suv92 (а) і вихідного штаму S. sioyaensis Lv81 (б).

Дані, отримані в роботі, дають змогу визначити кілька основних підходів до селе­кції штаму S. sioyaensis Lv81, спрямованої на підвищення рівня синтезу сіоміцину. З отриманих результатів випливає, що оптимальним для селекційних робіт є вирощуван­ня штаму на повноцінному живильному середовищі СС-14 на основі соєвого борошна. УФ-опромінення S. sioyaensis Lv81 у дозі, що знижує виживання спор до близько 0,2%, є ефективним способом отримання клонів культури з підвищеним рівнем синтезу сіомі-цину. Вперше доведено, що для пошуку штамів з підвищеною продукцією сіоміцину можна використати метод, заснований на стимулюванні сіоміцином росту штаму S. livi-dans ТК24, який містить плазміду pMO16 з геном канаміцин- і неоміцин-стійкості neo під контролем tipA-промотора.

1. Громико О. М., Федоренко В. О. Вплив мутагенів на антибіотичну активність Strep-tomyces nogalater IMET43360 - продуцента протипухлинного антибіотика ногала-міцину // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. 2005. Вип. 40. С. 16-22.

2. Жукова Р. А., Коммунарская А. Д., Пронина М. И. и др. Методы селекции продуце­нтов антибиотиков и ферментов. Л.: Медицина, 1978. 160 с.

б

3. Bagley M. C., Dale J. W., Merritt E. A., XiongX. Thiopeptide antibiotics // Chem. Rev. 2005. Vol. 105. P. 685-714.

4. Baltz R. Mutation in Streptomyces // The bacteria. The treatise on structure and function. Vol.IX. Antibiotic-producing Streptomyces / Ed. by S.W. Qbeener, E. Day. Orlando: Academic Press, Inc. 1986. P. 61-94.

5. Bhat U. G., Zipfel P. A., Tyler D. S., Gartel A. L. Novel anticancer compounds induce apoptosis in melanoma cells // Cell Cycle. 2008. Vol. 7. P. 1851-1855.

6. Holmes D., Caso J., Thompson C. Autogenous transcriptional activation of a thiostrepton-induced gene in Streptomyces lividans // EMBO. J. 1993. Vol. 12. P. 3183-3191.

7. Kieser T., Bibb M., Buttner M., Chater K., Hopwood D. Practical Streptromyces genetics. Norwich, England: John Innes Foundation. 2000. 634 p.

8. Liao R., Duan L., Lei C. еt al. Thiopeptide biosynthesis featuring ribosomally synthe­sized precursor peptides and conserved posttranslational modifications // Chem. Biol. 2009. Vol. 16. Р. 141-147.

9. McConkey G. A., Rogers M. J., McCutchan T. F. Inhibition of Plasmodium falciparum

protein synthesis // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 2046-2049.

10. Myronovskyy M., Ostash B., Ostash I., Fedorenko V. A gene cloning system for the sio-mycin producer Streptomyces sioyaensis NRRL-B5408 // Folia Microbiol. 2009. Vol. 54. P. 91-96.

11. Trilli A., Costanzi I., Lamanna F., DiDio N. Development of agar disc method for the rapid screening of strains with increased productivity // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1982. Vol. 32. P. 281-291.

12. Ueno M., Furukawa S., Abe F. et al. Suppressive effect of antibiotic siomycin on anti­body production // J. Antibiot. 2004. Vol. 57. P. 590-596.

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

О Аравіцька - Вплив ультрафіолетового опромінення на антибіотичну активність продуцента сіоміцину