Л Шакіна, В Страшнюк, В Шахбазов - Вплив ізогенізації на ступінь політенії й активність пуфінгу політенних хромосом у drosophila melanogaster meig - страница 1

Страницы:
1  2 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF L'VIV UNIV.

Серія біологічна. 2005. Вип. 40. С. 23-29 Biology series. 2005. Is. 40. P. 23-29

УДК 575.22:576.316.352

ВПЛИВ ІЗОГЕНІЗАЦІЇ НА СТУПІНЬ ПОЛІТЕНІЇ Й АКТИВНІСТЬ ПУФІНГУ ПОЛІТЕННИХ ХРОМОСОМ У DROSOPHILA MELANOGASTER MEIG.

Л. Шакіна, В. Страшнюк, В. Шахбазов

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна пл. Свободи, 4, Харків 61077, Україна e-mail: LyubovZ2003@mail.ru

Досліджено вплив ізогенізації на ступінь політенії й активність пуфі-нгу політенних хромосом у Drosophila melanogaster. З'ясовано, що процес ізогенізації хромосом негативно впливає на функцію ендоредуплікації у самок дрозофіли, суттєво не змінюючи її у самців. Виявлено пригнічення транскрипційної активності політенних хромосом у локусах 2EF, 50CD, 71CE, 72CD, 83E та її посилення в локусі 21F у процесі ізогенізації. У локу­сах 22C, 23E, 63F, 82EF, 93D розміри пуфів суттєво не змінювалися. Отри­мані дані є важливими для розуміння механізмів впливу ізогенізації хромо­сом на адаптивно важливі ознаки дрозофіли.

Ключові слова: дрозофіла, ізогенізація хромосом, політенні хромосоми, ен-доредуплікація, пуфінг.

Ізогенізація, як процес одержання лише гомозиготних диплоїдів, уже давно приве­ртає увагу дослідників. Перехід до високогомогенних ліній значно підвищує ефектив­ність багатьох генетичних досліджень, різко прискорюючи дослідницький процес завдя­ки мінімізації генетичної різноманітності. Можливість виведення чистих, чи гомозигот­них ліній також дає змогу вирішити низку теоретичних і практичних завдань селекції. Незважаючи на практичний інтерес до процедури ізогенізації хромосом, генетичні ефек­ти цього явища все ще вивчені недостатньо, особливо на хромосомному рівні, пов' язано-му зі збереженням, передаванням і початковими етапами експресії генетичної інформації.

Політенні хромосоми, характерні для личинкових тканин багатьох представників Dіptera, є унікальним об'єктом для аналізу реплікативної і транскрипційної активності хромосом. Вони виникають у результаті багатьох послідовних реплікацій кожної з хро­мосом диплоїдного набору і діють як інтерфазні хромосоми. Ступінь політенії - показник кількості елементарних ниток ДНП - відображає реплікативну активність хромосом і є одним із показників інтенсивності метаболізму [1]. Конформаційні зміни хромосомних дисків у пуфи - ділянки найактивнішого синтезу РНК - є характерним проявом транс­крипційної активності генетичних елементів політенних хромосом [3].

Ми мали на меті дослідити вплив ізогенізації на функцію ендоредуплікації і пуфо-ву активність політенних хромосом DrosophUa melanogaster. Дослідження проводили на лінії BarC-S (контроль), отриманій шляхом восьми насичувальних схрещувань мух неселе-ктованої мутантної лінії Bar (B;1-57,0) з мухами дикої лінії Canton-S (C-S) та лінії BarC-S, ізогенної за хромосомами 2, 3, - isoII isoIII BarC-S (дослід).

Мух вирощували на стандартному цукрово-дріжджовому середовищі при темпера­турі 24±0,5 оС. Ізогенізацію хромосом проводили відповідно до класичної схеми з вико­ристанням лінії-балансера Cy/Pm; D/Sb [16]. Політенні хромосоми досліджували на дав­лених ацетоорсеїнових препаратах слинних залоз [7] зі збільшенням мікроскопа 800.

Ступінь політенії хомосом (СПХ) досліджували у личинок наприкінці третьої ста­дії розвитку. Відомо, що на цей час у них припиняється ініціація нових циклів ендореду-

© Шакіна Л., Страшнюк В., Шахбазов В., 2005плікації, і хромосоми досягають ступенів політенії 256C, 512C, 1024C і 2048C [26]. Від­мінності в СПХ визначали за допомогою цитоморфометричного методу [13]. Вимірюван­ня виконували в ділянці диска 224 хромосоми 2L, який приблизно відповідає середній ширині хромосом. Поперечні розміри хромосом з різним ступенем політенії становлять, відповідно, 1,6; 2,3; 3,2; 4,5 мкм. Чим більший ступінь політенії хромосом, тим інтенсив­ніше їх забарвлює ацетоорсеїн. Визначали відсотковий вміст ядер з різним ступенем по-літенії на тотальних препаратах слинних залоз. За результатами цих даних розраховували середні значення політенії в кожному варіанті експерименту. Самок і самців досліджува­ли окремо, по 10-11 личинок у кожному варіанті експерименту. Всього досліджено 41 личинку дрозофіли.

Для оцінки пуфінгу політенних хромосом у дослід брали самок на стадії 0-годинної передлялечки. Цю стадію легко ідентифікувати за вивертанням дихалець. Розмі­ри пуфів оцінювали на хромосомах з однаковим ступенем політенії 1024С. Облік ступеня політенії в подібних дослідженнях дуже важливий з огляду на прояв ефекту дози генів -зворотну залежність між пуфовою активністю і рівнем політенії хромосом [17]. Локалізу­вали пуфи за уточненими картами Бриджеса [24]. Досліджували одинадцять пуфів трьох великих хромосом дрозофіли: 2EF (хромосома 1); 21 F, 22C, 23E (хромосома 2L); 50CD (хромосома 2R); 63F, 71CE, 72CD (хромосома 3L); 82EF, 83E, 93D (хромосома 3R). Попе­речні розміри пуфів вимірювали за допомогою окуляр-мікрометра і порівнювали їх з ши­риною прилеглого диска, не залученого до процесу пуфіювання. Співідношення розміру пуфа до розміру диска слугувало мірою пуфової активності: 2EF/2D, 21F/22B, 22C/22B, 23E/24C, 50CD/51B, 63F/64B, 71CE/73A, 72CD/73A, 82EF/84A, 83E/84A і 93D/93F. Згідно з даними авторадіографічних досліджень, розміри пуфів корелюють з рівнем транскрип­ційної активності локусів [25]. Середні розміри пуфів визначали, досліджуючи 25-40 ядер у кожному варіанті експерименту у вибірці з 5-17 личинок, не більше п'яти ядер на кожному препараті. Вірогідність розходжень оцінювали за критерієм Стьюдента.

% ядер

Середній ступінь політенії

100 90 80 70 60 50 40 ЗО 20 10 0 1000

900

800

700

600

500

400

300

200

100

0

Bar c-s

Bar c-s, ізогенна за хромосомами 2,3

Bar c-s

Bar c-s, ізо генна за хромосомами 2, З

□ а По Ов Шг

Рис. 1. Розподіл ядер з різним ступенем політенії хромосом у слинних залозах ліній BarC-S та isoII isoIII BarC-S: Ширина хромосом, мкм: а - 1,6 (ступінь політенії 256С); б - 2,3 (512С); в - 3,2 (1024С); г - 4,5 (2048С); д - середній ступінь політенії.

Результати дослідження впливу ізогенізації хромосом 2, 3 D. melanogaster на реп-лікативну активність політенних хромосом відображені на рис. 1. Показано, що процес ізогенізації хромосом негативно впливав на функцію ендоредуплікації політенних хромо­сом у самок D. melanogaster, суттєво не змінюючи її у самців. Зниження середнього сту­пеня політенії хромосом у самок становило 8,16% >0,999). Аналіз відсоткового співвід­ношення ядер з різним ступенем політенії хромосом у самок засвідчив значне зростання частки ядер зі ступенем політенії 512С - на 48,10% >0,99) у досліді. Одночасно просте-жено тенденцію до зниження кількості ядер з рівнем політенії 1024С і 2048С - на 8,26 та 93,70%, відповідно та зростання відсотка ядер з найменшим ступенем політенії (256С) - на 56,11%.

Крім загальної картини зміни ступеня політенії хромосом в умовах експеримен­ту, проаналізовано статеві відмінності за цим показником. Виявлено, що в контролі самці мали нижчі показники СПХ порівняно з самками (див. рис. 1). Статеві розхо­дження за показником СПХ становили 6,94% >0,99). В умовах досліду статеві розхо­дження недостовірні.

Для вивчення ефекту ізогенізації хромосом на транскрипційному рівні досліджува­ли активність пуфінгу політенних хромосом на стадії 0-годинної передлялечки (рис. 2). В лінії isoII isoIII BarC-S виявлено зниження розмірів пуфів порівняно з гетерогенною лінією BarC-S в локусах 2EF, 50CD, 71CE, 72CD, 83E на 11,72 >0,99), 10,65 >0,95), 22,41 >0,999), 16, 80 >0,99) та 16, 04 % >0,95), відповідно. Одночасно зареєстровано по­силення пуфової активності в локусі 21F на 11,06 % >0,95). У локусах 22C, 23E, 63F, 82EF, 93D розміри пуфів суттєво не змінювалися.

Ізогенізація хромосом є важливим генетичним чинником та еквівалентна швидко­му інбридингу. Ми визначили збільшення частоти виникнення домінантних летальних мутацій, а також частоти мутування в локусі Bar лінії BarC-S в процесі ізогенізації хромо­сом 2, 3 D. melanogaster [4]. Літературних даних щодо впливу на реплікативну здатність і пуфінг політенних хромосом такого генетичного чинника, як ізогенізація, нема, щодо інбридингу вони суперечливі (за одними даними впливу немає, за іншими - він може бути досить значним).

3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 -1,00 -0,50 0,00 -

ш

О!

О

Q

О

Пуфи

Bar c-s П Bar c-s, ізо генна за хромосомами 2, З Рис. 2. Розміри пуфів політенних хромосом дрозофіли у зв'язку з ізогенізацією хромосом 2, 3.

Дослідження впливу генотипу на СПХ дрозофіли не дали значних розходжень між інбредними лініями Oregon-R (Or), Swedish (Sw) і міжлінійними гібридами F1 Or х Sw и Sw х Or [11, 12]. З іншого боку, реципрокні гібриди F1 НА х ВА и ВА х НА значно пере­вершували інбредні батьківські лінії НА (низькоактивна) та ВА (високоактивна) за показ­ником СПХ [13].

Вивчення пуфової активності політенних хромосом у інбредних ліній Oregon-R (Or) і Canton-S (C-S) та міжлінійного гібрида F1 Or х C-S не виявило значних генетич­них розходжень за розмірами великих пуфів хромосоми 3 [17]. Аналогічно, аналіз на­бору і розмірів 65 пуфів у Х-хромосомах слинних залоз дрозофіли із природної популя­ції Алма-Ата, трьох лабораторних аутбредних ліній (Батумі-Л, Oregon-R, Canton-S) і двох високоінбредних ліній НА і ВА не виявив ніякої тенденції до зменшення активно­сті пуфів за умов інбридингу [2]. Однак є дані, що після 36-41 поколінь інбридингу в личинок третього віку D. melanogaster знижується частота виникнення 28 з 114 дослі­джених пуфів [6], а також після 288 поколінь інбридингу в 0-2,5-годинних передляле-чок простежується зменшення загальної кількості активних ділянок хромосом у D. subobscura з 138 до 96 [23]. У дослідженнях на стадії 0-годинної передлялечки гібриди F1 НА х ВА та ВА х НА перевершували інбредні батьківські лінії НА та ВА за показни­ком активності пуфінгу політенних хромосом у низці з досліджених локусів трьох ве­ликих хромосом дрозофіли [15].

Наведені розходження за оцінками реплікативної і пуфової активності політенних хромосом у деяких випадках можуть бути пов' язані з різними методами дослідження. Автори, як звичайно, оцінювали розміри пуфів візуально, у балах; точнішими є вимірю­вання за допомогою об' єкт-мікрометра. Крім того, не враховували ефекту дози генів на рівні транскрипції - існування зворотної залежності пуфової активності від ступеня полі-тенії гігантських хромосом [17]. Водночас генетична варіабельність оцінюваних парамет­рів у різних ліній може бути дуже значною [10, 19].

Результати, отримані в наших дослідженнях, свідчать про переважно негативний вплив процесу ізогенізації хромосом на реплікативну і пуфову активність. Цікаво те, що зміна транскрипційної активності генів є системною, торкається як ізогенізованих, так і не ізогенізованої Х-хромосоми (локус 2EF). В наших дослідженнях ізогенізація хромо­сом призводила також до зниження виходу імаго на 31,32% >0,95) у самок та на 30,37% <0,95) у самців, що узгоджується з результатами праць [10-12, 14], у яких описано зв'я­зок проявів функцій політенних хромосом з адаптивно важливими ознаками.

У зв' язку з проведеними дослідженнями постає питання про можливі механізми впливу ізогенізації хромосом D. melanogaster на функцію ендоредуплікації і пуфову ак­тивність політенних хромосом. З огляду на той факт, що ізогенізація геному призводить до майже повної гомозиготності лінії, можна припустити, які пригнічення реплікативної і пуфової активності політенних хромосом може бути пов' язане з вищепленням у гомози­готній формі різних "дефектних" генів, у тому числі регуляторних, що контролюють про­цеси реплікації і транскрипції ДНК. Останніми роками накопичено дані про генетичні чинники, що впливають на швидкості транспозицій і ексцизій різних мобільних генетич­них елементів (МГЕ) у дрозофіли [18]. У деяких випадках доведено, що частоти транспо­зицій і ексцизій МГЕ зростають за умов інбридингу. Наприклад, Б' ємонт зі співавт. ви­явили "вибухи" транспозицій МГЕ соріа [21] і Р-елемента [20] у деяких високоінбредних лініях дрозофіли. Ді Франко зі співавт. [22] знайшли надлишкову гетерозиготність МГЕ

copіa, I, jockey, МДГ4 в інбредних лініях, що пояснили індукцією транспозицій. У пра­цях Ратнера зі співавт. наведені дані щодо безпосередньої участі процесу ізогенізації хромосом в індукції масових переміщень копій МГЕ Dm412. Швидкості індукції транс­позицій і ексцизій копій МГЕ становлять близько 10-1-10-2 подій на сайт, на гаплоїдний геном, за цикл ізогенізації, що на один-два порядки перевищує спонтанний рівень транспозицій і фактично призводить до реорганізації всього малюнка локалізації копій МГЕ Dm412 геному [8]. Аналогічно, Кайданов зі співавт. довів, що ізогенізація великих хромосом лінії НА є індукувальним чинником переміщень hobo-елемента в системі Н-Е гібридного дисгенезу [5]. Відповідно до сучасних даних, рухливі елементи, потрапляю­чи в гени, можуть не тільки їх інактивувати, спричинюючи мутації, а й здатні суттєво змінювати характер експресії генів [9]. З огляду на той факт, що різні типи мобільних елементів є дуже чутливими об' єктами щодо генетичних впливів, можна припустити, що вони також відіграють певну роль у зміні регулювання активності генів у процесі ізогенізації.

Отже, виявлено пригнічення функції ендоредуплікації і зниження транскрип­ційної активності в деяких локусах політенних хромосом у процесі ізогенізації. Описано статеві відмінності за показником СПХ в контролі: більші значення дослі­дженої ознаки у самок порівняно з самцями. Отримані дані варто враховувати під час обговорення можливих механізмів впливу ізогенізації хромосом на життєво ва­жливі ознаки дрозофіли.

1. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и диффере-нцировка. М.: Наука, 1981. 260 с.

2. Беляева Е.С., Жимулев И.Ф. О вариабельности размеров пуфов у Drosophila melanogaster // Генетика. 1974. Т. 10. № 5. С. 74-80.

3. Жимулев И.Ф. Хромомерная организация политенных хромосом. Новосибирск:

Наука, 1994. 565 с.

4. Журавлева Л.А., Страшнюк В.Ю., Шахбазов В.Г. Влияние стрессовых факторов на геном Drosophila melanogaster // VIII Междунар. науч. экол. конф. Белгород,

2004. С. 65-66.

5. Кайданов Л.З., Галкин А.П., Иовлева О.В., Сиделева О.Г. Направленные перемеще­ния по геному мобильного элемента хобо в длительно селектируемой линии на Drosophila melanogaster // Цитология и генетика. 1996. Т. 30. № 1. С. 23-30.

6. Лычев В.А. Изучение активности хромосом при глубоком инбридинге у дрозофи­лы // Цитология. 1965. Т. 7. № 3. С. 325-329.

7. Полуэктова Е.В., Евгеньев М.Б. Техника изготовления препаратов политенных хромосом // Методы биологии развития. М.: Наука, 1974. С. 517-519.

8. Ратнер В.А., Васильева Л.А. Индукция транспозиций и эксцизий мобильных гене­тических элементов у дрозофилы в процессе изогенизации // Генетика. 1996. Т. 32.

№ 7. С. 933-944.

9. Сингер М, Берг П. Гены и геномы. М.: Мир, 1998. Т. 1. 373 с.

10. Страшнюк В.Ю. Генетична вариабельність та адаптивні модифікації ступеня політенії гігантських хромосом у Drosophila melanogaster // Тр. по фундамент. и прикл. генетике. Харьков: Штрих, 2001. С. 285-295.

11. Страшнюк В.Ю., C. Аль-Хамед, Непейвода C.H., Шахбазов В.Г. Цитогенетичес-кое и цитобиофизическое исследование механизмов температурных адаптаций и эффекта гетерозиса у Drosophila melanogaster Meig // Генетика. 1997. Т. 33. № 6.

С. 793-799.

12. Страшнюк В.Ю., Аль-Хамед С., Шаламов Ю.А., Шахбазов В.Г. Изменение струк­туры и функции политенных хромосом как механизм температурной адаптации и эффекта гетерозиса у дрозофилы // Доп. НАН України. 1995. № 5. С. 139-142.

13. Страшнюк В.Ю., Непейвода С.Н., Шахбазов В.Г. Цитоморфометрическое исследо­вание политенных хромосом Drosophila melanogaster Meig. в связи с эффектом гетерозиса, отбором по адаптивно важным признакам и полом // Генетика. 1995. Т. 31. № 1. С. 24-29.

14. Страшнюк В.Ю., Таглина О.В., Шахбазов В.Г. Экдизонзависимые изменения акти­вности пуфов онтогенеза в слюнных железах дрозофилы, культивируемых in vitro, в связи с эффектом гетерозиса и отбором по адаптивно важным признакам // Гене­тика. 1991. Т. 27. № 9. С. 1512-1518.

15. Таглина О.В. Исследование структурно-функциональных особенностей политен-ных хромосом Drosophila melanogaster Meig. в связи с эффектом гетерозиса и раз­личиями по адаптивно важным признакам: Автореф. дисс... канд. биол. наук. Харь­ков, 1992. 17 с.

16. ТихомироваМ.М. Генетический анализ. Л.: Изд-во Ленинград. ун-та, 1990. 280 с.

17. Шаламов Ю. А. Температурные условия проявления эффекта гетерозиса у Droso-phila melanogaster Meig: Автореф. дисс... канд. биол. наук. Харьков, 1996. 17 с.

18. Щербата Г.Р., Максимів Д.В., Черник Я.І. Індукована мобільними генетичними елементами нестабільність генів у Drosophila melanogaster // Цитология и генетика. 1999. Т. 33. № 1. С. 54-70.

19. Эшбернер М. Генетический и гормональный контроль пуфинга политенных хромо­сом Drosophila melanogaster // Онтогенез. 1974. Т. 5. № 2. С. 107-121.

20. Biemont C., Arnault С., Heizmann A., Ronsseray S. Massive changes іп genome local­ization of P elements in an inbred line of Drosophila melanogaster // Naturwissen-schaften. 1990. Vol. 77. P. 485-488.

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

Л Шакіна, В Страшнюк, В Шахбазов - Вплив ізогенізації на ступінь політенії й активність пуфінгу політенних хромосом у drosophila melanogaster meig