О Устянська, Д Нікітінський - Вплив ін'єкцій тіаміну на активність катепсин-l-та катепсин-в-подібних ферментів у тканинах білих щурів - страница 1

Страницы:
1 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF LVIV UNIV.

Серія біологічна. 2009. Вип. 49. С. 38-42 Biology series. 2009. Is. 49. P. 38-42

Біохімія

УДК 577.15:591.466(043.5)

ВПЛИВ ІН'ЄКЦІЙ ТІАМІНУ НА АКТИВНІСТЬ КАТЕПСИН-L-ТА КАТЕПСИН-В-ПОДІБНИХ ФЕРМЕНТІВ У ТКАНИНАХ БІЛИХ ЩУРІВ

О. Устянська, Д. Нікітінський, С. Петров

Одеський національний університет імені 1.1. Мечникова пров. Шампанський, 2, Одеса 65058, Україна e-mail: ustjansky_olga@ukr.net

Досліджено активність катепсин-L- і катепсин-В-подібних фермен­тів під дією внутрішньом'язової ін'єкції тіаміну. Введення тіаміну змен­шує активність катепсині-подібних ферментів у тканинах печінки та тон­кого кишечника через одну годину. Встановлено, що тіамін, введений in vivo, діє неоднозначно на катепсин-В-подібні протеїнази. Обговорюється можлива некоферментна дія тіаміну на активність катепсин-L- та катепсин-В-подібних ферментів.

Ключові слова: тіамін, катепсині-подібні ферменти, катепсин-В-подібні ферменти, некоферментна дія.

Зацікавлення вивченням катепсинів обґрунтовано тим, що вони проявляють ви­соку біологічну активність. Зокрема, цистеїнові катепсини відіграють істотну роль у таких важливих процесах життєдіяльності організму, як процеси росту, диференціація клітин та ін. Вони здійснюють частковий протеоліз деяких ферментів, регулюючи та­ким чином їхню активність [4, 8].

Активність катепсинів регулюється багатьма чинниками, одним із яких є вітамі­ни. Літературні дані свідчать про можливість існування некоферментної дії метаболітів тіаміну на сірковмісні ферменти [6, 7]. Але ці дані є результатом лише поодиноких до­сліджень. Було встановлено, що деякі продукти катаболізму тіаміну, які утворюються в організмі, проявляють власні ефекти, не пов' язані з коферментними функціями. Деякі досліди вказують на те, що сам тіамін і особливо продукти його окислення та розпаду в організмі здатні діяти на активність багатьох ферментів [6, 7].

Якщо в експериментах з очищеними ферментами можна впевнено говорити про існування чи відсутність некоферментної регуляції тіаміном і його метаболітами того чи іншого ферменту, то в дослідах in vivo в більшості випадків така констатація неможлива.

У багатьох дослідах було відмічено зниження ферментативної активності під впливом тіаміну, що не може бути результатом коферментної дії цього вітаміну.

Особливе місце серед некоферментних функцій тіаміну займає проблема регуля­ції обміну сірковмісних сполук.

Катепсини L і В, які є тіоловими протеїназами, здатні взаємодіяти в організмі з деякими сірковмісними сполуками. Проте ця здатність практично не вивчена.

Метою нашої роботи було вивчити вплив тіаміну на активність цистеїнових про-теїназ, зокрема катепсин-L- та катепсин-В-подібних ферментів, у деяких органах щурів.

Досліди проводили на щурах лінії Wistar, загальною кількістю 50 тварин масою 180-200 г. Тварин тримали у стандартних умовах віварію Одеського національного університету ім. Мечникова. За добу до дослідів припиняли харчування, але давали пи­ти воду.

© Устянська О., Нікітінський Д., Петров С., 2009

Введення тіаміну проводили шляхом внутрішньом' язової ін' єкції. Контрольній групі щурів вводили по 0,2 мл фізіологічного розчину, а дослідній групі - 0,2 мл тіаміну у концентрації 10 мг в 1 мл (що відповідає 2 мг тіаміну на грам маси).

Для дослідження використовували гомогенати печінки, нирок і тонкого кишеч­ника.

Тканини гомогенізували в 0,9% розчині NaCl у співвідношенні 1:10 протягом 4-5 хв.

Отриманий гомогенат тканин центрифугували за 8.000 g (+4°С) протягом 30 хв.

Визначення активності катепсині-подібних протеїназ проводили за методом Чорної [12] у модифікації І. Л. Вовчук, С. С. Чернадчук [1]. Метод базується на визначенні кількості продуктів гідролізу білкового субстрату - азоказеїну. Оптичну щільність визначали при довжині хвилі 366 нм, на спектрофотометрі СФ-26.

Активність катепсин-В-подібних ферментів визначали за кількістю продуктів гідролізу синтетичного субстрату N-бензоїларгінін-п-нітроаніліду при рН 6,0 за мето­дом Erlanger [13], у модифікації С. С. Чернадчук, І. Л. Вовчук [11]. Оптичну щільність визначали при довжині хвилі 383,5 нм.

Питому активність виражали в мкмолях на мг білка.

Білок визначали за методом Lowry [15].

Для обчислення отриманих результатів застосовували методи статистичного ана­лізу з використанням параметричних критеріїв оцінки розбіжності між вибірками. Дос­товірно різними вважалися результати при P<0,05 [9].

За літературними даними, в різних органах тварин катепсини L і В представлені нерівномірно. Найбільшою активністю даних ферментів характеризуються тканини ни­рок і печінки. Слід зазначити, що активність катепсинів може коливатися залежно від стану клітин. Так, активність катепсину L у печінці щурів після 24-годинного голоду­вання тварин знижується в 6 разів, а активність катепсину В - зростає у 100 разів [4, 5].

За результатами наших дослідів активності катепсині-подібних ферментів у гомогенатах тканин білих щурів (печінки, нирок, тонкого кишечника), у контрольній групі тварин, яким вводили фізіологічний розчин, були отримані такі дані (табл. 1). Найбільшу активність катепсині-подібних ферментів виявлено в тканинах тонкого кишечника (1,339 мкмоль/мг білка), мінімальну - в тканинах печінки (0,457 мкмоль/мг білка). У тканинах нирок активність ферменту порівняно з тонким кишечником незнач­но менша і становить 1,077 мкмоль/мг білка.

Наступний етап наших дослідів був присвячений вивченню динаміки зміни акти­вності катепсині-подібних ферментів при введенні тіаміну.

Таблиця 1

Питома активність катепсині-подібних ферментів під впливом тіаміну в тканинах білих щурів (мкмоль/мг білка; М±м; n=50)

Органи

Контроль

Час після введення тіаміну

 

 

1 год                   6 год

Печінка Нирки Тонкий кишечник

0,457±0,098 1,077±0,364 1,339±0,489

0,367±0,029 0,860±0,060* 1,112±0,181 1,201±0,066 0,877±0,065* 1,266±0,112

Примітка. * - ймовірна різниця щодо контролю P<0,05.

Після внутрішньом' язового введення тіаміну спостерігалося зниження активності катепсині-подібних ферментів щодо показників контрольної групи через одну годину у тканинах печінки та тонкого кишечника.

У тканинах білих щурів активність катепсині-подібних ферментів була різною та змінювалася протягом однієї-шести годин. Після введення тіаміну впродовж першої години в більшості випадків спостерігалася тенденція до зниження активності катепсин-L-подібних ферментів, а в тонкому кишечнику відзначено імовірне зменшення на 40%.

Через 6 год досліджуваний показник приходить до норми, а в печінці становить 140% від норми. Очевидно, це свідчить про існування циклічності біохімічних процесів у організмі тварин.

При визначенні активності катепсин-В-подібних ферментів (табл. 2) у гомогена­тах тканин тварин контрольної групи ми встановили максимальне значення досліджуваного показника в тканинах печінки (0,070 мкмоль/мг білка). Мінімальна активність досліджуваних ферментів виявлена у тканинах нирок (0,010 мкмоль/мг білка). У тканинах тонкого кишечника вона становила 0,020 мкмоль/мг білка, що у 2 рази більше порівняно з нирками та у 3,5 разу менше порівняно з печінкою.

Таблиця 2

Питома активність катепсин-В-подібних ферментів у тканинах білих щурів під впливом тіаміну (мкмоль/мг білка; М±м; n=50 )

Органи

Контроль

Час після введення тіаміну

 

 

1 год                       6 год

Печінка Нирки Тонкий кишечник

0,070±0,048 0,010±0,006 0,020±0,001

0,072±0,013 0,020±0,001* 0,040±0,023* 0,030±0,012* 0,022±0,005 0,010±0,005*

Примітка.* - ймовірна різниця що до контролю, P<0,05.

Введення тваринам тіаміну приводило до збільшення активності катепсин-В-подібних ферментів у тканинах нирок в 4 рази через 1 год і в 3 рази - через 6 год порів­няно з контролем.

Під дією внутрішньом' язової ін' єкції тіаміну в тканинах печінки та тонкого кишечника активність ферментів через 1 год практично не змінювалась. Зменшення активності катепсин-В-подібних ферментів було найбільш виразним через 6 год у тка­нинах печінки (у 3,5 разу) та у тканинах тонкого кишечника (у 2 рази) порівняно з контролем.

Таким чином, вищевказані зміни активності досліджених протеїназ, можливо, пов' язані з проявами некоферментних функцій тіаміну, які в даному випадку можуть реалізуватися на рівні дисульфідних взаємодій між тіаміном і цистеїновими залишками активного центру фермента.

Підсумовуючи результати проведених досліджень, можна зробити висновок, що під впливом ін' єкцій тіаміну в тканинах нирок виявлена стимуляція активності катеп-син-В-подібних ферментів. Введення тіаміну в експерименті in vivo знижує активність катепсин-В-подібних протеїназ у тканинах печінки та тонкого кишечника білих щурів через 6 год. Після внутрішньом'язового введення тіаміну активність катепсин-L-подібних ферментів у тканинах печінки та тонкого кишечника знижувалася через однугодину. Наведені у роботі досліди свідчать про наявність некоферментної дії метаболі­тів тіаміну на досліджувані ферменти.

1. Вовчук И. Л., Чернадчук С. С. Активность тканевых катепсині-подобньгх протеиназ у женщин с онкопатологией тела матки // Укр. биохим. журн. 2004. № 2. С. 56-60.

2. Дилакян Э. А. Цистеиновые протеиназы при неопластической трансформации //

Вопр. мед. хим. 2000. Т. 46. № 5. С. 490-491.

3. Дилакян Э. А., Гуреева Т. А., Звездилина С. Л. и др. Особенности взаимодействия катепси-на L с ингибиторами цистеиновых протеиназ из культур трансформированных фібро-бластов и ингибиторами из актиномицет // Вопр. мед. хим. 2000. Т. 46. № 5. С. 508-509.

4. Жлоба А. А. Очистка, идентификация и свойства цистеиновых катепсинов тканей животных // Укр. биохим. журн. 1986. Т. 58. № 4. С. 100-111.

5. Жлоба А. А., Дунаевский В. А. Активность секретируемых форм цистеиновых ка-тепсинов в крови в качестве маркера процессов тканевого роста // Вопросы онко­логии. 1996. Т. 42. № 1. С. 70-76.

6. Петров С. А. Некоферментные эффекты тиамина и его метаболитов // Биомед. хи­мия. 2006. Т. 52. Вып. 4. С. 335-345.

7. Петров С. А. Роль катаболитов тиамина в регуляции обмена амино- и кетокислот // Материалы IX Укр. биохим. съезда. Харьков, 24-27 октября 2006 г. Харьков. С. 163.

8. Потеряева О. Н., Короленко Т. А., Свечникова И. Г. и др. Цистеиновые протеиназы и их ингибиторы при развитии мышиной НА-1 гепатомы и противоопухолевой терапии // Биомед. химия. 2004. Т. 50. № 2. С. 172-179.

9. Рокицкий П. Ф. Биохимическая статистика. Минск: Высш. шк., 1973. 230 с.

10. Руденская Г. Н., Пупов Д. В. Цистеиновые протеиназы микроорганизмов и виру­сов // Бихимия. 2008. Т. 73. Вып. 1. С. 3-17.

11. Чернадчук С. С., Вовчук И. Л. Активность катепсина В в опухолевой ткани репро­дуктивных органов женщин // Ученые записки Таврич. нац. ун-та. Сер. биол. 2003. Т. 16 (55). № 2. С. 202-207.

12. Черная В. И., Рева А. Д. Активность катепсина Н в мозге и опухолях мозга челове­ка // Укр. биохим. журн. 1989. Т. 61. № 5. С. 47-50.

13. Erlanger B. F. et al. The preparation endopeptidases of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Вюсіїет. Biopfys. 1961. Vol. 95. P. 271-278.

14. Jose Maria Pfizer, Irmgard Assfalg-Machleidt, Werner Machleidt et al. Primed-site Probing of Papain-like Cysteine Proteases // International J. of Peptide Research and Therapeutics formerly known as "Letters in Peptide Science". 2006. P. 44-67.

15. Lowry O. H., Rosenbrough N. I., Fan A. Z., Randol R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

INFLUENS OF INJECTION OF THIAMINE ON CATHEPSIN-L- AND CATHEPSIN-B-LIKE ENZYMES AKTIVITY IN WHITE RAT'S TISSUES

O. Ustjansky, D. Nikitinsky, S. Petrov

Mechnikov National University of Odessa 2, Shampanskyi Lane, Odessa 65058, Ukraine e-mail: ustjansky_olga@ukr.net

Activity of cathepsin-L- and cathepsin-B-like proteinases under activity of intra muscular injection of thiamin has been studied. Injection of thiamine reduces the activity of cathepsin-L-like proteinases in tissues of liver and small intestine in an hour. It is established, that thiamine injected in vivo act the com­plex on cathepsin-B-like enzymes in organs of some rats. Probable noncofer-ment activity of thiamine on cathepsin-L- and cathepsin-B-like proteinases is discussed in white rat's tissues.

Key words: thiamine, cathepsin-L-like proteinases, cathepsin-B-like enzymes, noncoferment activity.

ВЛИЯНИЕ ИНЪЕКЦИЙ ТИАМИНА НА АКТИВНОСТЬ КАТЕПСИН-L- И КА-ТЕПСИН-В-ПОДОБНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ТКАНЯХ БЕЛЫХ КРЫС

О. Устянская, Д. Никитинский, С. Петров

Одесский национальный университет имени И. И. Мечникова пер. Шампанский, 2, Одесса 65058, Украина e-mail: ustjansky_olga@ukr.net

Исследована активность катепсин-L- и катепсин-В-подобных фер­ментов под действием внутримышечных инъекций тиамина. Введение тиа­мина уменьшает активность катепсин^-подобных ферментов в тканях печени и тонкого кишечника через один час. Установлено, что тиамин, введенный in vivo, действует неоднозначно на катепсин-В-подобные про-теиназы. Обсуждается возможное некоферментное воздействие тиамина на активность катепсин-L- и катепсин-В -подобных ферментов.

Ключевые слова: тиамин, катепсин-L- и катепсин-В-подобные ферменты, некоферментное воздействие.

Стаття надійшла до редколегії 07.10.08 Прийнята до друку 10.12.08

Страницы:
1 


Похожие статьи

О Устянська, Д Нікітінський - Вплив ін'єкцій тіаміну на активність катепсин-l-та катепсин-в-подібних ферментів у тканинах білих щурів