К Костюк - Вплив іонів цинку свинцю та дизельного палива на ліпідний склад мембран клітин водних рослин - страница 1

Страницы:
1  2 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF LVIV UNIV.

Серія біологічна. 2010. Вип. 54. С. 257-264    Biology series. 2010. Is. 54. P. 257-264

УДК 576.314:576.344+581.522.5:582.263

ВПЛИВ ІОНІВ ЦИНКУ, СВИНЦЮ ТА ДИЗЕЛЬНОГО ПАЛИВА НА ЛІПІДНИЙ СКЛАД МЕМБРАН КЛІТИН ВОДНИХ РОСЛИН

К. Костюк, В. Грубінко

Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка вул. М. Кривоноса, 2, Тернопіль 46027, Україна

У статті наведено дані про вплив іонів цинку, свинцю та дизельного палива водного середовища на ліпідний склад мембран клітин водних рос­лин - хлорели, елодеї та ряски. Обговорюється можлива участь різних класів ліпідів у адаптації водних рослин до дії досліджуваних токсикантів.

Ключові слова: водні рослини, важкі метали, дизельне паливо, мембрани, ліпіди.

Відомо, що структурні та динамічні характеристики мембранних ліпідів можуть змінюватися під впливом різних факторів: температури, тиску, рН, неорганічних іонів, ксенобіотиків тощо [17]. Клітини відповідають на ці впливи зміною кількісного, а іноді й якісного складу мембран [18]. Тому вивчення впливу токсичних факторів на ліпідний склад мембран як ключових елементів взаємозв'язку між зовнішнім середовищем і вну­трішньоклітинними відповідями водних рослин, може прояснити питання резистентнос­ті або вразливості водних рослин.

Метою роботи було вивчення зміни ліпідного складу мембран клітин водних рос­лин за дії іонів цинку (метаболічний регулятор), свинцю та дизельного палива (неспецифічні токсиканти).

Дослідження проводили на хлорелі СМогеїїа vulgaris Beijer., елодеї Elodea canadensis і рясці Lemna minor L. Хлорелу вирощували в умовах накопичувальної куль­тури в люменостаті при освітленні лампами денного світла (2500 лк) і температурі 20±1°С на живильному середовищі Фітцжеральда в модифікації Цендера та Горхема (№ 11) [10]. Елодею та ряску вирощували в акваріумах з відстояною водопровідною водою в тих самих умовах. В експериментах до культури рослин у кожному випадку окремо додавали водні розчини солей металів ZnSO4 7H2O і Pb (NO3)2 з розрахунку на іон: Zn2+ - 1,0 мг/дм3, 2,0 і 5,0 мг/дм3; Pb2+ - 0,1 мг/дм3, 0,2 і 0,5 мг/дм3, що відповідає 1, 2 і 5 ГДК, а також дизельне паливо (ДП) в кількості 0,01 мг/дм3; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 мг/дм3, що становить 1, 5, 10, 20, 30 ГДК відповідно згідно з рибогосподарськими показниками шкідливості [4, 13]. Період інкубації водоростей із токсикантами становив 1, 3, 7 і 14 діб. Контролем були рослини, які росли в середовищі без токсикантів.

Клітинні мембрани виділяли за методикою Фіндлея та Еванза [14] з гомогенатів біо­маси водних рослин (відділяли центрифугуванням при 1500 g, 20 хв), отриманих у механіч­ному гомогенізаторі при 7000 об./хв у 5 мМ трис-HCl буфері (рН 7,6), що містив 0,5 М саха­рози, 0,005 М ЕДТА, 0,01 М КС1 та 0,001 М MgCl2 (сира маса: об'єм буфера - 1:5), центри­фугуванням при 5000 об./хв протягом 15 хв. Осад, що містив клітинні мембрани, ресус-пензували у верхній фазі розчину, отриманого змішуванням двофазної системи розчинів 0,25 М сахарози і 30%-ного поліетиленгліколю в 0,2 М розчині фосфату натрію, попередньо витриманого 24 год при 4°С. Суспензію розподіляли порівну в три полікарбонатні пробірки об' ємом 50 мл, у кожну додавали 10 мл нижньої фази суміші розчинів, змішували та цен-

© Костюк К., Грубінко В., 2010к

cS ft

ю cs S

° g

^ 'S

cS о о

г

к

CS ft

ю cs S

:^ s ° к ср £

^ 'S

cS о о

К cS CP

ю

к s

О CD

CS S ° К

CP Щ

u H 'S

cS о о

контроль цинк

свинець

ДП

frfi

1

7^

7^

7

'I5 1 14

7

3

7f7

7

1 15 I

74

1 I 5 110120130 14

ГДК доби

контроль цинк_свинець

ДП

трифугували при 2000 g 15 хв у бакет-роторі. Мембранний матеріал відбирали у місці розділення фаз за допомогою шприца. Усі процедури здійснені при 4оС.

Ліпіди екстрагували хлороформ-метанольною сумішшю у співвідношенні 2:1 за методом Фолча [6]. Неліпідні домішки видаляли відмиванням 1% розчином KCl [12]. Кі­лькість загальних ліпідів ви­значали ваговим методом 35 після відгонки екстрагуваль-ної суміші [6]. Розділення ліпідів на окремі фракції здійснювали методом висхід­ної одномірної тонкошарової хроматографії в силікагелі на скляних пластинках після попереднього активування розділяючого шару [7] з ви­користанням суміші гексану, диетилового етеру та льодя­ної оцтової кислоти у спів­відношенні 70:30:1 [12]. Хро-матограми проявляли в парах кристалічного йоду. Кіль­кість неполярних ліпідів ви­значали біхроматним мето­дом спектрофотометрично при довжині хвилі 615 нм [12]. Вміст фосфоліпідів піс­ля їхньої мінералізації при температурі 180°С визначали за кількістю неорганічного фосфору за методом Вась-ковського [21].

Отримані результати опрацьовані методами варіаційної статистики [9].

Порівняльний аналіз ліпідного складу клітин хло­рели, елодеї та ряски, які росли у середовищі з важки­ми металами (ВМ) і дизпа-ливом (ДП), показав різни­цю у вмісті мембранних лі­підів порівняно з контроль­ним середовищем існування водних рослин (див. рису­нок).

1

3

7

1 М 14

1

3

7

1\5\ 14

1 І 5 110 120 130

ГДК

доби

контроль цинк свинець

ДП

І і і

і\7 1

1\5 3

1 5 7

1\5\ 14

1 5

1

і\7

3

1\5

7

1\5\ 14

1 І 5 110 120 130

ГДК

доби

Загальний вміст ліпідів у мембранах клітин хлорели (Ш), елодеї (б) та ряски (в) при дії ВМ і ДП, M±m, n=3.

При стресовому впливі вміст ліпідів у мембранах суттєво збільшується. Так, цинк стимулює накопичення ліпідів у всіх досліджуваних водних рослин. Їхня кількість зростає як у міру збільшення концентрації металів до 5 ГДК, так і зі збільшенням часу дії до 7 діб. До 14-ї доби дії кількість ліпідів у досліджених водних рослин стає близь­кою до контрольних показників. Найбільший загальний вміст ліпідів виявлений у хло­рели (5 ГДК, 7-ма доба), найменший - у елодеї, що може бути пов' язано як з будовою її клітинної оболонки, так і з додатковими захисними утвореннями на поверхні листків багатоклітинних рослин.

У хлорели накопичення ліпідів максимальне при дії свинцю. Їх вміст практично удвічі вищий, ніж у контролі на 3-7-му доби дії іонів металу, після чого рівень ліпідів поступово знижується до контрольних значень. У елодеї та ряски динаміка вмісту ліпідів аналогічна, однак зниження їхньої кількості починається вже на 7-му добу дії металу, як і у разі дії цинку. Порівняно з цинком збільшення вмісту ліпідів при дії свинцю в усіх досліджених рослин у середньому на 10-15% вища, а у елодеї в 3,4 разу, що свідчить про стресовий вплив на водяні рослини сполук свинцю як типового токсиканта [24].

Дизельне паливо також стимулює накопичення ліпідів у всіх водних рослин, більше у хлорели і ряски. Зростання вмісту ліпідів удвічі відзначене до концентрації ДП 10 ГДК. При вищих концентраціях їхній вміст знижується, але він все ж вищий, ніж у контролі. Оскільки тривалий (до 14 діб) вплив токсикантів викликав зниження вмісту ліпідів, то можна припустити вичерпання їхньої структурно-функціональної здатності до захисту від дії токсикантів, бо раніше показано, що тривалий вплив металів (мідь, кадмій, цинк) на водні рослини спричиняє зниження загального вмісту ліпідів [20], при­чому чим вища токсичність металу, тим значніше зменшується загальний вміст ліпідів.

Щодо видових відмінностей чутливості водних рослин до токсикантів, то хлоре­ла активно накопичує ліпіди при дії всіх досліджених токсикантів, причому приблизно на одному рівні. У елодеї максимум накопичення ліпідів викликають іони свинцю, потім ДП й іони цинку, у ряски - ДП і приблизно однаково іони металів. Такі розбіжності можуть бути пов' язані з особливостями будови клітин рослин, оскільки окремі клітини хлорели формують захисний мембранний бар' єр самостійно, а багато­клітинні утворення у ряски й елодеї - за рахунок покривних тканин, фізіології та спосо­бу життя (хлорела й елодея - занурені, а ряска - поверхнево плаваюча, що пояснює її чутливість до ДП, яке має поверхнево-активні властивості), а також особливостями енергетичного та пластичного обмінів [3].

У зв' язку з виявленими закономірностями виникає питання про співвідношення вмісту основних класів ліпідів. Високу стійкість мембран пристосованих рослин пов' я-зують, зокрема, з якісними та кількісними змінами у складі їхніх ліпідів, перш за все триацилгліцеролів і фосфоліпідів [15]. Тому нами досліджено кількісні зміни вмісту триацилгліцеролів (ТАГ), диацилгліцеролів (ДАГ), фосфоліпідів (ФЛ) та неетерифікова-них жирних кислот (НЕЖК) (див. таблицю). Кількість ліпідів у мембранах водних рос­лин значно збільшувалася при дії всіх токсикантів. Домінуючими групами є ТАГ і ФЛ. Поряд із тим, відносний вміст ДАГ і НЕЖК також зростав. Підвищення вмісту ТАГ -один із факторів стабілізації мембран, тому що у фізіологічних умовах вони є поперед­никами утворення ДАГ і НЕЖК [19]. Вміст ТАГ у водних рослин порівняно з іншими ліпідами вищий у 1,5-2 рази. Дія іонів цинку сприяла збільшенню їхньої кількості у хло­рели більш ніж удвічі, елодеї - у 2-3 рази, ряски - в 1,5-2 рази. Максимальне збільшення ТАГ виявлено на 7-му добу при 5 ГДК за дії іонів цинку.

Іони свинцю стимулювали максимальне накопичення ТАГ у всіх водних рослин на третю добу дії. Більше накопичення ТАГ при дії обох металів було при їхній концен­трації у середовищі культивування 5 ГДК, на 20-25% вище, ніж при концентрації 1 ГДК.

ДП також стимулювало накопичення ТАГ із максимумом при 5 ГДК у хлорели (у 2,5 рази більше, ніж у контролі), а в елодеї і ряски у 2-2,5 разу більше при 10 ГДК, порівняно з контролем.

Співвідношення вмісту ТАГ: ДАГ:ФЛ:НЕЖК у водних рослин при дії токсикантів, %

Токсикант

Умови впливу

Рослини

 

Тривалість дії, діб

ГДК

Хлорела

Елодея

Ряска

 

Контроль

-

39:31:2:27

42:27:3:28

42:29:3:26

Zn2+

1

1

51:23:2:24

52:23:2:23

45:26:5:24

 

 

5

46:30:2:22

53:24:1:22

47:25:6:22

 

3

1

52:28:2:18

45:27:2:26

45:27:4:24

 

 

5

48:30:2:20

51:25:2:22

38:28:6:28

 

7

1

44:30:2:24

55:22:3:20

40:26:7:27

 

 

5

44:31:2:23

52:23:4:21

39:25:8:28

 

14

1

46:25:2:27

47:27:2:24

47:25:3:25

 

 

5

51:25:2:22

50:24:2:24

45:27:3:25

Pb2+

1

1

38:26:15:21

58:16:8:18

43:29:3:25

 

 

5

30:21:28:21

58:16:8:18

44:30:4:22

 

3

1

37:21:25:17

50:21:9:20

38:27:9:26

 

 

5

36:20:26:18

49:18:11:22

41:24:10:25

 

7

1

33:22:23:22

52:17:8:23

40:26:9:25

 

 

5

33:17:29:21

50:18:9:23

42:24:9:25

 

14

1

40:20:22:18

47:22:8:23

43:24:9:24

 

 

5

39:22:22:17

47:22:8:23

43:25:9:23

ДП

14

1

53:15:10:22

50:23:12:15

49:17:14:20

 

 

5

49:20:15:16

58:17:8:17

48:20:14:18

 

 

10

46:23:16:15

46:17:13:24

46:18:12:24

 

 

20

49:20:13:18

49:20:12:19

52:18:12:18

 

 

30

52:15:13:20

53:18:10:19

51:15:14:20

Отримані результати свідчать про те, що накопичення ТАГ є типовою реакцією водних рослин на дію токсикантів. Це узгоджується з літературними даними, згідно з якими рівень накопичення триацилгліцеролів у клітинах хлорели при стресі може ста­новити 80% їхньої сухої біомаси [2]. Можна припустити єдиний механізм участі ТАГ у стабілізації мембран клітин водних рослин при токсичній дії, оскільки збільшення вміс­ту ТАГ співвідноситься з ущільненням і зниженням плинності мембран [5].

Як відомо, стресовий вплив на мембранні ліпіди активує ліпази та фосфоліпази [11]. Тому разом зі зростанням рівня ТАГ у всіх водних рослин підвищувався вміст у мембранах ДАГ, ФЛ і, відповідно, НЕЖК.

У хлорели іони цинку та свинцю в обох концентраціях підвищували вміст ДАГ. Максимальне їх накопичення при дії іонів цинку спостерігали на сьому добу, а свинцю -на третю, після чого вміст ліпідів цієї групи зменшувався на 60-70%. У елодеї та ряски динаміка накопичення була аналогічною, проте вміст ДАГ до кінця експерименту змен­шувався лише на 10-15% від максимальних значень (7-ма доба). Щодо ДП, то макси­мальне накопичення ДАГ у всіх водних рослин спостерігали при 10 ГДК токсиканта. Збільшення його концентрації знижувало вміст ліпідів у мембранах клітин до значень, близьких до контрольних.

Отже, клітини на дію всіх токсикантів реагували накопиченням ДАГ, найбільше при середньотоксичних концентраціях протягом першого тижня дії токсикантів.

Одними з найбільш функціонально значимих компонентів мембран є фосфоліпі-ди, які не тільки впливають на їхню плинність, а й формують мікросередовище для мем­бранних ферментів, іонних каналів, а також регулюють зв'язок клітин із зовнішнім се­редовищем [16]. У хлорели іони цинку стимулювали накопичення ФЛ з першої доби дії, а максимум накопичення спостерігали на 7-му добу, у більшій мірі при 5 ГДК металу. На 14-ту добу вміст ФЛ знижувався. Аналогічна залежність характерна для елодеї та ряски. Однак, якщо у хлорели максимальне відхилення показників вмісту ФЛ від кон­тролю було дворазовим, то у елодеї кількість ФЛ щодо контролю зростала у 5-6 разів (на 3-7-му добу, 5 ГДК), а у ряски в 10-15 разів (на 3-тю і 7-му доби, 5 ГДК металів). Отже, протягом тижня рослини активно накопичували ФЛ, після чого їхній вміст у мем­бранах до 14 діб знижувався. Іони свинцю діяли подібно. Вже у концентрації 1 ГДК вони сприяли збільшенню вмісту ФЛ у хлорели на першу добу дії у 5 разів, на третю добу - практично у 10 разів. Максимальне накопичення спостерігали на 3-тю і 7-му добу дії при 5 ГДК металу в середовищі.

Схожа закономірність виявлена у елодеї та ряски з максимальним накопиченням ФЛ на третю добу (у 10 разів щодо контролю) при дії свинцю. Рівень ФЛ у всіх до­сліджених водних рослин при дії свинцю був вищим, ніж у контролі: у хлорели - в 14 разів, у елодеї - у 8 разів, у ряски - в 7 разів, що відрізняє дію свинцю від іонів цинку. ДП стимулює накопичення ФЛ у всіх досліджених водних рослин практично у 10-15 разів порівняно з контролем при всіх досліджених концентраціях токсиканта.

Отже, у відповідь на дію токсикантів усі досліджені водні рослини накопичували у мембранах ФЛ. Загальною закономірністю є максимум адаптивних можливостей мем­бран при 5 ГДК металів протягом 7 діб їхньої дії, і за 10 ГДК ДП. Збільшення концен­трації токсиканта і часу його дії знижує адаптивно-захисні можливості клітин, що співвідноситься з їхніми ушкодженнями при тривалому впливі токсикантів у високих концентраціях.

Можливо, інтенсивність цього процесу пояснюється високою сорбційною здатні­стю заряджених фосфоліпідів [23]. Крім того, відомо, що фосфоліпіди можуть викону­вати функції месенджерів, які передають інформацію всередину клітини про зміни на­вколишнього середовища [22], а це розширює їхнє функціональне значення в інтоксико-ваних клітинах водних рослин.

Вміст НЕЖК може бути як показником посиленого розпаду ліпідів, так і їхнього синтезу, вказуючи на інтенсивність їх метаболізму [8]. При цьому має значення їхній якісний склад. Загалом динаміка накопичення НЕЖК у хлорели при дії обох металів близька до інших класів ліпідів. Іони цинку стимулювали нагромадження кислот на 7-му добу при 5 ГДК (удвічі щодо контролю). Дія свинцю, ймовірно, стресова, оскільки вміст НЕЖК щодо контролю зростає на 80% (5ГДК) вже протягом перших діб дії, по­ступово знижуючись до 14-ї доби. Можливо, швидке утворення НЕЖК є наслідком розщеплення ліпідів, а синтез жирних кислот при цьому пригнічується. На відміну від хлорели, у ряски й елодеї вміст НЕЖК зростає, як зі збільшенням діючої концентрації металів, так і з часом дії: для іонів цинку - до 7-14-ї діб, для іонів свинцю - до 3-ї доби.

ДП у хлорели також збільшує вміст НЕЖК до концентрації 5 ГДК, після чого показник знижується. Вміст НЕЖК у елодеї та ряски був найбільшим при концентрації 10 ГДК ДП, причому в 4 рази більше в елодеї, і в 1,5-2 рази у ряски, ніж у контролі, і при інших концентраціях ДП.

Отже, за дії всіх досліджених токсикантів у водних рослин, незалежно від часу дії та концентрації речовин у середовищі вирощування водних рослин, спостерігається загальна тенденція до накопичення в мембранах ТАГ і ФЛ, які, очевидно, мають адап­тивне значення у захисті клітин водних рослин від дії токсикантів. Це співвідноситься з даними інших досліджень [2], у яких показано, що ТАГ і ФЛ стабілізують структурно-функціональний стан мембран клітин водних рослин у відповідь на дію несприятливих чинників.

Отримані дані свідчать про те, що клітини досліджуваних водних рослин реагу­ють на пошкоджувальну дію важких металів і нафтопродуктів підвищенням синтезу основних адаптивних ліпідів. Наші висновки співвідносяться з даними роботи [20], в якій продемонстровано, що водні рослини, які ростуть у середовищі з металами, здійс­нюють активну реструктуризацію клітинного метаболізму з метою підтримання клітин­них структур, що забезпечують функціонування пігментного апарату і фотосинтезу. Така адаптивна перебудова складу мембранних ліпідів у відповідь на токсичну дію є звичайним явищем для багатьох рослин [2] і водночас компенсаторним механізмом, спрямованим на підтримання структурно-функціональної цілісності мембран [17]. Ви­явлені зміни також можуть бути спрямовані на оптимізацію проникності мембран, іон­ного транспорту і функціонування ферментів [1].

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

К Костюк - Вплив іонів цинку свинцю та дизельного палива на ліпідний склад мембран клітин водних рослин