Н Матійців - Генетичне картування х-зчеплених нейродегенеративних мутацій у drosophila melanogaster - страница 1

Страницы:
1 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF L'VIV UNIV.

Серія біологічна. 2005. Вип. 39. С. 54-59 Biology series. 2005. Is. 39. P. 54-59

Генетика

УДК 575.24: 577.7

ГЕНЕТИЧНЕ КАРТУВАННЯ Х-ЗЧЕПЛЕНИХ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНИХ МУТАЦІЙ У DROSOPHILA MELANOGASTER

Н. Матійців

Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського, 4, м. Львів 79005, Україна e-mail: m.n.p@mail.ru

Проаналізовано нейродегенеративні мутації Drosophila melanogaster, індуковані етилметансульфонатом, на домінантність/рецесивність. Виявле­но, що серед 11 мутацій, які зумовлюють структурні зміни в мозку, дві домі­нантні та дев'ять рецесивних. Шляхом делеційного картування чотири реце­сивні мутації локалізовано в певних ділянках Х-хромосоми: мутації 60-15 та 60-16 у 012D02 ділянці Х-хромосоми або 013А02 - 05; мутації 61-7 та 65-10 у 001А01 або 002А ділянці Х-хромосоми.

Ключові слова: Drosophila melanogaster, нейродегенерація, генетичний ана­ліз, делеційне картування.

Нейродегенерація є характерною ознакою хвороб центральної нервової системи, що виявляються в пізньому онтогенезі в різноманітних організмів - від людини до нематод. Багато досліджень [6, 10, 16] на червах, плодових мушках, мишах та людях дало змогу ви­явити, що подібні патології мають в основі ушкодження на генетичному рівні: часто це є результатом мутантної зміни лише одного гена. Деякі мутації Drosophila спричиняють тка­нинно-специфічну нейродегенерацію в разі старіння [9]. Подібні дослідження на Drosophila melanogaster достатньо інформативні, вони доводять, що плодова мушка - це хороша сис­тема для моделювання нейродегенеративних розладів людини [18, 10]. Наприклад, експре­сія людського а-синуклеїну і tau білків у нервовій системі дрозофіли спричиняли розвиток нейродегенеративних змін, які за багатьма фенотиповими проявами нагадували хвороби Паркінсона та Альцгеймера [20]. Молекулярні механізми цих захворювань стали зрозумі­лими завдяки використанню генетичних методів, що дають змогу швидко ідентифікувати і клонувати гени, які відповідають за ці відхилення. Значна фенотипова подібність у прояві різних нейродегенеративних розладів між дрозофілою та людиною свідчить, що дрозофіла - вдалий модельний об'єкт для з'ясування ключових механізмів.

Крім моделювання дегенерації нервової системи шляхом експресії людських генів у геномі дрозофіли, триває пошук нових генних мутацій, що зумовлюють нейродегенерацію. До відомих Х-зчеплених мутантів зі змінами в мозку належать drop-dead, swiss cheese, eg-groll, spongecake, bubblegum [5, 13, 15, 15]. Вони мають знижену тривалість життя порівня­но з особинами дикого типу та виявляють пов' язану з віком нейропатологію.

Ми мали на меті виконати генетичне картування нейродегенеративних мутацій D. melanogaster в певній ділянці Х-хромосоми. У дослідженнях використано 11 ліній нейродегенеративних мутантів по Х-хромосомі, отриманих шляхом індукованого етилме-тансульфонатом мутагенезу [1] та лінію дикого типу Oregon. Тестерними лініями слугу­вали культури 998 та 1329, одержані з Bloomington Drosophila Stock Center (університет штату Індіана, США): 998 Df(1)RK2/FM7a і 1329 Df(1)BA1, w[*]/FM7a; Dp(1;2)E1, y[+]/+; самки цих ліній в одній з Х-хромосом несуть делецію, а в іншій - маркерні мутації.

© Матійців Н., 2005

Тест на домінантність нейродегенеративних мутацій полягав у проведенні індиві­дуальних реципрокних схрещувань особин мутантних ліній з лінією дикого типу Oregon. Аналізували особин першого покоління: якщо гетерозиготна особина виявляла мутант­ний фенотип - зміни в структурі мозку, то мутацію вважали домінантною; якщо ж у са­мок першого покоління не виявлялось змін у тканині мозку, то мутацію зачислювали до рецесивних.

Локалізацію рецесивних мутацій проводили шляхом схрещування самців нейроде-генеративних мутантів по Х-хромосомі із самками лінії, що несе делецію у певній ділянці Х-хромосоми (рис. 1). Завдяки наявності домінантної маркерної мутації Bar у тестерної лінії [14] серед гетерозиготних самок першого покоління відбирали для аналізу тих, у яких не виявляли фенотипу Bar. Це означало, що у них в одній з гомологічних хромосом міститься нейродегенеративна мутація, а в іншій - делеція.

Фенотиповий аналіз мозку виконували у самок 20-денного віку на гістологічних препаратах, які виготовляли за стандартною методикою [13]. Препарати аналізували за допомогою мікроскопа Carl Zeiss Jena зі збільшенням 12*40 в ультрафіолетовому світлі. Дрозофіл утримували при температурі 25°С у цукрових склянках на стандартному пожи­вному середовищі [3]. Тестуванням 11 Х-зчеплених мутантних ліній D. melanogaster зі структурними змінами в мозку на домінантність виявлено дев' ять культур (2-14, 60-15, 60-16, 61-7, 65-10, 72-2, 72-7, 76-15, 77-4) з рецесивним фенотипом та дві культури (67-2 і 71-21) з домінантним.

З використанням делеційного картування для локалізації рецесивних мутацій ми провели 18 схрещувань самок делеційних ліній з самцями нейродегенеративних мутан­тів. Результати схрещувань наведені в таблиці. Мутації 60-15 та 60-16 локалізовано в ділянці делецій, які несла лінія 998, а саме: 012D02 або 013A02-05 Х-хромосоми. Ділянка 013A02-05 захоплює місце, в якому картовано відомі мутації drop-dead, ethergo-go, в ді­лянці 012D02 Х-хромосоми картовано ген bendless. Усі ці гени задіяні у формуванні структур головного мозку.

Р: ?       FM7a Шаг)        X $

Ваг-фенотип

FM7a(Bar) Df       (1) FM7a (Bar) Df (1)

F:

аналізували

Рис. 1 Схема схрещування нейродегенеративних мутантантів дрозофіли по Х-хромосомі з деле-ційними лініями: *m - схематичне позначення нейродегенеративної мутації, яку несе Х-хромосома; Df (1) - схематичне позначення Х-хромосоми, що несе делецію.

Результати схрещувань нейродегенеративних мутантів D. melanogaster з делеційними лініями, n = 2

Лінії

2-14      60-15     60-16      61-7      65-10     72-2     72-7      77-4 76-15

998 1329

+          ММ          +          +          +         +         + + +          +          +          ММ         +         +         + +

Примітка.:+ - Нормальний фенотип; M - мутантний фенотип.

Відомо [5], що мутанти drop-dead мають дуже коротку тривалість життя - біль­шість особин гинуть на четвертий день після вильоту імаго. Продуктом гена eag є одна з субодиниць калієвого каналу [7, 4, 21]. Мутація в цьому гені спричиняє порушення збуд­ливості моторних нейронів, ольфакторної чутливості, поведінкових реакцій - знижується здатність до навчання, у самців змінюється ритуал залицяння [7]. Всі фенотипові прояви цієї мутації зумовлені дефектною структурою калієвих каналів. Також є дослідження Ягера та ін. [21], які доводять участь гена eag у процесах формування глії. Ген ben кодує протеїн, який близько споріднений з убіквітинозв' язувальним ферментом, що каталізує ковалентне приєднання убіквітину до протеолітичного субстрату. Міссенс-мутація в ді­лянці висококонсервативного активного центра ферменту призводить до ряду функціона­льних змін на організменому рівні [17, 8, 19], серед яких - порушення утворення синап-тичних зв' язків між нейронами центральної нервової системи. Можна припустити, що нейродегенеративні мутанти 60-15 та 60-16, одержані в нашій лабораторії, містять мута­цію в одному з цих генів. Максимальна тривалість життя особин ліній 60-15 та 60-16 ста­новить 35 та 43 дні, відповідно, що на 52-41% менше, ніж в особин дикого типу [2], але значно більше, ніж у мух з мутацією drop-dead. Зазначені факти свідчать, що мутація в гені eag може бути причиною нейродегенеративних змін у структурі мозку дрозофіли, а цей ген може бути кандидатом для детального вивчення. На підставі цього ми припускає­мо, що в нашій лабораторії одержані мутації, які можуть бути алельними формами мута-цїй drop-dead, eag, ben.

Мутації 61-7 та 65-10 картовано в ділянках 001А01 або 002А Х-хромосоми, які відповідають делеціям тестерної лінії 1329 (див. таблицю). Описана Бензером та Міном [15] мутація spongecake локалізована в одній з цих ділянок - 001А01. Мухи spongecake живуть до 60 днів, що лише на 17% менше від тривалості життя у мух дикого типу. Зміни в структурі мозку в разі мутації spogecake виявляються у значній вакуолізації тканини в оптичній ділянці мозку [15]. Подібні характеристики тривалості життя та нейродегенера-тивного фенотипу має лінія 65-10 (рис. 2, б). Це дає підстави вважати, що зміни у мозку особин цієї лінії зумовлені мутацією саме в гені spogecake, однак для точного стверджен­ня необхідно виконати молекулярний аналіз.

Щодо лінії 61-7, то вона має дещо інші фенотипові прояви: тривалість життя ста­новить 45 днів, а нейродегенеративні зміни виявляються у вигляді зон відмирання нерво­вої тканини по всій структурі мозку (див. рис. 2, в). Тому ми припускаємо, що мутацію 61-7 треба картувати в ділянці 002А Х-хромосоми. Ця ділянка досить велика (100 Kb) (рис. 3) і містить 16 генів, функція яких ще не відома: CG3056, CG14772, CG14773, CG3719,   CG32813,   CG14774,   CG11448,   CG14785,   CG14779,   CG14786, CG14787,

CG14788, CG14780, CG14777, CG32808, CG14778. Шляхом комп'ютерного аналізу з'я­совано, до якого класу належать продукти таких генів: SNF 1A - треонінкіназа, O-fut2 -фукозилтрансфераза. Ген l(1)2Ac у гомозиготному стані спричиняє летальний ефект. Серед інших генів, картованих у цій ділянці, є описаний у літературі ген futsch [12, 22].

Рис. 2. Фенотип мутантів D. melanogaster з морфологічними змінами структури головного мозку: а - лінія дикого типу Oregon; б - лінія 65-10 (вакуолізація нервової тканини в оптичній ділянці мозку); в - лінія 61-7 (обширні зони відмирання по всій структурі мозку).

2A

2A3

2B

1135

 

1189

 

1235

—І  І  І І  І  І  і іг~г

CG3056

»

CG14772

SNF1A

CG3719

І    І    І    І    І    І    І    І    І І

futsch      CG14785 CG14779

► ►

CG14788

CG14773

l(1)2Ac

CG32813

CG14774

CG11448

Рис. 3. Ділянка 002А цитологічної карти Х-хромосоми D. melanogaster.

Щ CG14786

\ CG14787 4 CG14780 4 O-fut2

) CG14777

{ CG32808

I CG14778

в

Продукт цього гена складається з 5327 амінокислотних залишків і бере участь у форму­ванні мікротубул. Білок Futsch експресується лише в нервовій системі та необхідний для формування дендритів і аксонів під час ембріонального розвитку [12, 22]. Мутація в цьо­му гені може спричинювати ранню нейродегенерацію, подібну до тої, яка простежується в особин 61-7.

Для точнішої локалізації описаних мутацій необхідні додаткові експерименти що­до полімеразно-ланцюгової реакції клонування відповідних генів та визначення їхньої повної нуклеотидної послідовності. Порівняння цих даних з нуклеотидними послідовнос­тями генів дикого типу дасть змогу виявити можливі причини нейродегенеративних по­рушень у мутантних ліній та передбачити молекулярні механізми процесів, що є в основі цих змін.

1. Щepбaтa Г.Р., Матийцив Н.П., Чepник Я.И., Maкcимив ДЗ. Химически индуциро­ванный мутагенез у Drosophila melanogaster с целью получения мутантов с измене­ниями в структуре мозга // Генетика. 2004. Т. 40. № 9. С. 1280-1285.

2. Щepбaтa Г.Р., Матийцив Н.П., Чepник Я.И., и др. Генетический анализ нейродеге-неративных мутантов Drosophila melanogaster по Х-хромосоме, индуцированных этилметансульфонатом и нитрозоэтилмочевиной // Генетика. 2004. Т. 40. № 9. P. 1286-1292.

3. AshburnerM. Drosophila. N.Y.: Cold Spring Harbor Univ. Press., 1989. Vol. 1. 1331 p.

4. Broughton S.J., Kitamoto T, Greenspan RJ. Excitatory and inhibitory switches for court­ship in the brain of Drosophila melanogaster // Curr Biol. 2004. Vol. 14. P. 538-47.

5. Buchanan R.L., Benzer S. Defective glia in the Drosophila brain degeneration mutant drop-dead // Neuron. 1993. Vol. 10. P. 839-850.

6. Driskoll M., Gerstbrein B. Dying for a case: invertabrate genetics takes on human neu-rodegeneration // Nature Review Genetics. 2003. Vol. 4. P. 181-194.

7. Dubin A.E., LilesM.M., Harris G.L. The K1 Channel Gene Ether a Go-Go Is Required for the Transduction of a Subset of Odorants in Adult Drosophila melanogaster // J. of Neuro-science. 1998. Vol. 18. P. 5603-5613.

8. Edgecomb, R.S., Ghetti, C., Schneiderman, A.M. Bendless alters thoracic musculature in interacting neurotransmitter-mediated signaling pathways // PNAS. 2001. Vol. 98.

P. 10445-10450.

9. Feany M.B., Bender W.W. A Drosophila model of Parkinson's disease // Nature. 2000.

Vol. 404. P. 394-398.

10. Fortini M.E., Skupski M.P., Boguski M.S. et al. A survey of human disease gene counter­parts in the Drosophila genome // J. Cell Biol. 2000. Vol. 150. F23-F30.

11. Heisenberg M., Bohl K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histologi­cal means // Z Naturforsch. 1979. Vol. 4. P 143-147.

12. Hummel T., Krukkert K., Roos J. et al. Drosophila Futsch / 22C10 is a MAP1B like protein required for dendritic and axonal development // Neuron. 2000. Vol. 26. P. 357-370.

13. Kretzschmar D., Hasan G., Heisenberg M., Benzer S. The swiss cheese mutant glial hy-perwrapping and brain degeneratoin in Drosophila // J.Neurosci. 1997. Vol. 17. N 19.

P. 7425-7432.

14. Lindsley D., Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster. NY.: Academic Press,

1992. 523 p.

15. Min K. T. and Benzer S. Spongecake and eggroll: the hereditary diseases in Drosophila resemble pattern of human brain degeneration // Curr. Biol. 1997. Vol. 7. P. 885-888.

16. Min K.T., Benzer S. Preventing neurodegeneration in the Drosophila mutant bubblegum // Science. 1999. Vol. 284. P. 1985-1988.

17. Muralidhar M.G., Thomas J.B. The Drosophila bendless gene encodes a neural protein related to ubiquitin-conjugating enzymes // Neuron. 1993. Vol. 11. P.253-266.

18. Mutsuddi M., Nambu J.R. Neural disease: Drosophila degenerates for a good cause // Curr. Biol. 1998. Vol. 8. R809 - 811.

19. Thomas R.E., Fort M., Cone.D. Photoreceptor pathfinding defects in Drosophila attractin homologue, distracted, mutants linked to an interaction with bendless // A. Dros. Res. Conf. 44. 2003. P .717.

20. Wittmann C.W., Wszolek M.F., Shulman P.M. et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegen-eration without neurofibrillary tangles // Science. 2001. Vol. 293. P. 711-714.

21. Yager J., Richards S., Hekmat-Scafe D. S. Control of Drosophila perineural glial growth by Drosophila // J. Neurogenet. 1993. Vol. 8(4). P. 201-219.

22. Zhang Y.Q., Bailey A.M., Matthies H.J. et al. Drosophila fragile Z-related the MAP1B homolog Futsch to control synaptic structure and function // Cell. 2000. Vol. 30.

P. 591-603.

GENETIC MAPPING OF DROSOPHILA MELANOGASTER X-BOUND NEURODEGENERATIVE MUTATIONS

N. Matiytsiv

Ivan Franko National University of Lviv Нrushevskogo str., Lviv 79005, Ukraine e-mail: m.n.p@mail.ru

Drosophila melanogaster ethylmethanesulphonate-induced neurodegen-erative mutations were analysed on dominance/recessiveness. It was found that, among 11 mutations causing brain changes, 2 mutations were dominant and 9 were recessive. By deficiency mapping, 4 recessive mutations were localized in certain areas of X chromosome: mutations 60-15 and 60-16 in 012D02 region or 013А02 05 region; mutations 61-7 and 65-10 in 001А01 or 002А region of X chromosome.

Key words: Drosophila melanogaster, neurodegeneration, genetic analysis, defi­ciency mapping.

Стаття надійшла до редколегії 31.12.2004 Прийнята до друку 17.01.2005

Страницы:
1 


Похожие статьи

Н Матійців - Генетичне картування х-зчеплених нейродегенеративних мутацій у drosophila melanogaster