Н Писаренко, Н Даниленко, В Мартиненко - Гіпотонічний лізис модифікованих еритроцитів людини - страница 1

Страницы:
1 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF L'VIV UNIV.

Серія біологічна. 2006. Вип. 42. С. 107-111    Biology series. 2006. Is. 42. P. 107-111

УДК 57.043.083.322:612.111

ГІПОТОНІЧНИЙ ЛІЗИС МОДИФІКОВАНИХ ЕРИТРОЦИТІВ ЛЮДИНИ

Н. Писаренко, Н. Даниленко, В. Мартиненко

Харківський національний університет імєні В.Н. Каразіна пл. Свободи, 4, Харків 61077, Україна e-mail: sniff81@mail.ru

Досліджено вплив модифікаторів на осмотичну стабільність еритро­цитів людини. Виявлено, що характер і глибина розвитку процесу гіпотоніч­ного лізису залежить від природи модифікатора і механізму його взаємодії з клітинними структурами. Чутливість еритроцитів людини до зміни осмоти­чних умов середовища контрольована станом цитоскелет-мембранного ком­плексу, функціонуванням аніонного переносника і циклу Якобса - Стеварта.

Ключові слова: гіпотонічний лізис, модифікатори, еритроцити людини.

Вивчення загальних закономірностей поведінки клітин а стресових умов для з'ясу­вання механізмів дії несприятливих чинників є актуальним завданням сучасної біологіч­ної науки. Еритроцит - це зручна модель для вивчення механізмів пошкодження клітин. Для аналізу збереження бар' єрної і транспортної функцій еритроцитарної мембрани в умовах стресу використовують дослідження гіпотонічного лізису. Це явище широко за­стосовують як тест на осмотичну ламкість еритроцитів [10] і функціональні порушення системи крові. У розвитку процесу гіпотонічного лізису можна виділити два етапи: набу­хання, спричинюване збільшенням потоку води в клітину та утворення макроскопічної пори в мембрані [9]. Осмотична поведінка еритроцитів за несприятливих умов визначена структурно-функціональною цілісністю цитоскелет-мембранного комплексу [1]. Модифікація клітинних структур сполуками різної хімічної природи значно впливає на стійкість еритроцитів до стресових чинників [1, 2, 6, 12], що може позначатися на осмо­тичній ламкості клітин. Дослідження гіпотонічного лізису модифікованих еритроцитів людини допоможе розкрити механізми розвитку чутливості клітин до зміни осмотичних умов середовища.

Ми мали на меті вивчити вплив модифікаторів: йодацетаміду (ІАА), парахлормер-курійбензоату (ПХМБ), ацетазоламіду, хлориду алюмінію, а також наявності в середови­щі гідрокарбонату натрію на гіпотонічний лізис еритроцитів людини.

В експериментах використовували еритроцити донорської крові другої групи. Еритроцити тричі відмивали центрифугуванням при 1 500 g протягом 3 хв. десятиразо­вим об'ємом розчину, що містив 150 ммоль/л NaCl (рН=7,4), і зберігали у вигляді густого осаду не більше 2 год при температурі 0оС. Усі середовища готували на 10 ммоль/л трис-буфері (рН=7,4).

Для проведення гіпотонічного лізису еритроцитів людини 10 мкл суспензії клітин (кінцевий гематокрит 0,5 %) переносили в 1,0 мл розчину, що містив 30-150 ммоль/л NaCl, та інкубували при температурі 22оС протягом 10 хв. Для обробки еритроцитів мо­дифікаторами клітини з 20% гематокритом виконували суспензування у середовищі об­робки, яке містило, ммоль/л: KCl - 90, NaCl - 45, сахароза - 44, трис-буфер - 10 (рН 7,4, 37оС) [4]. Модифікували еритроцити за схемою: IAA (фірми "Serva") у концентрації 15 ммоль/л (60 хв при t=37°C), ПХМБ (фірми "Реахім") у концентрації 1 ммоль/л (60 хв при t=37°C), у разі комбінованої обробки ІАА/ПХМБ проводили модифікацію ІАА в кон­центрації 15 ммоль/л (20 хв при t=37°C), після чого ПХМБ додавали у концентрації

© Писаренко Н., Даниленко Н., Мартиненко В., 2006

Н. Писаренко, Н. Даниленко, В. Мартиненко

1 ммоль/л (60 хв при t=37°C) [2, 13]. Клітини також попередньо обробляли ацетазо-ламідом у концентрації 5 ммоль/л при 37°С протягом 30 хв. Модифікацію еритроцитів хлоридом алюмінію виконували в концентрації 100-500 мкмоль/л протягом 30 хв при 37оС. Модифіковані еритроцити відмивали тричі десятиразовим об'ємом середовища обробки і двічі десятиразовим об'ємом 150 ммоль/л NaCl. Гіпотонічний лізис проводили також у середовищах, що містили 5 мкмоль/л гідрокарбонату натрію.

На рис. 1 показано результати дослідження гіпотонічного лізису еритроцитів у нормі та модифікованих IAA, ПХМБ та IAA/ПХМБ. Зниження концентрації хлориду на­трію в середовищі інкубації приведено до підвищення рівня гемолізу контрольних та мо­дифікованих клітин. Для оцінки початку розвитку гемолітичного процесу використову­ють показник порогової концентрації NaCl, за якої рівень лізису клітин досягає 10%. Чутливість еритроцитів до гіпотонічних умов середовища визначають показником індексу осмотичної ламкості (концентрація NaCl, за якої гемоліз дорівнює 50%).

Попередня обробка клітин IAA зумовлює підвищення чутливості еритроцитів до гіпотонічного лізису, у цьому разі рівень гемолізу досягає 77% за концентрації хлориду натрію 60 ммоль/л (60% лізису в контролі), значення порогової концентрації збільшується до 75 ммоль/л NaCl (67,5 ммоль/л NaCl у контролі), показник індексу осмотичної ламкості не змінюється і дорівнює 65 ммоль/л NaCl. Припускають [9, 10], що гемолітична пора - це динамічна молекулярна взаємодія, у її формуванні й стабілізації беруть участь мембранні білки, зокрема білок смуги 3. Відомо, що модифікація еритроцитів IAA блокує цитоплазма­тичний пул SH-груп і близько 50% SH-груп мембрани, цей реагент може заблокувати п'ять сульфгідрильних груп цитоплазматичного фрагмента білка смуги 3, проте IAA не взаємодіє з шостою ПХМБ-специфічною SH-групою [7, 8]. Отже, підвищення чутливості клітин, по­передньо оброблених IAA, до гіпотонічного лізису може бути пов' язане з модифікацією білків цитоскелета і мембрани, а також зі зміною конформації аніонного переносника.

Обробка еритроцитів ПХМБ спричинює зниження чутливості клітин до гіпотоніч­них умов середовища порівняно з контролем, у цьому випадку порогова концентрація дорівнює 65 ммоль/л NaCl, індекс осмотичної ламкості для модифікованих клітин зменшу­ється до 55 ммоль/л NaCl, а максимальне підвищення стійкості еритроцитів до дії гіпотонії простежується за концентрації 60 ммоль/л NaCl, рівень гемолізу клітин становить 30%.

150 135 120 105 90 75 60 45 30

Рис. 1. Гіпотонічний лізис модифікованих еритроцитів людини: 1 - контроль; 2 - ПХМБ; 3 - ІАА; 4 - ІАА/ПХМБ.

На рис. 2 відобра- 70

жена залежність гіпотоніч- 60

ного лізису еритроцитів у jo

нормі   й   модифікованих ^%

ПХМБ від часу гіпотоніч- = 40

о

ної інкубації (0-60 хв) в   § 30 середовищі,   що   містить 20 60 ммоль/л NaCl (/=22°C).      10 _| Виявлено, що зі збільшен­ням часу інкубації чутли- 0 вість контрольних клітин 0 10 20 30 40 5° 60

до   гіпотонічного   лізису ф   1 —Ш2 Час' хв

ПідвищуєтьсЯ на Початко-Рис. 2. Залежність гіпотонічного лізису еритроцитів від часу інкуба-вих стадіЯх шкубації (до ції в 6° мМоль/л NaCl: 1 - контроль; 2 - модифікація ПХМБ. 2 хв) ця тенденція вираженіша, подальше збільшення часу інкубації не впливає на дина­міку цього процесу. Попередня обробка еритроцитів ПХМБ змінює характер розвитку гіпотонічного лізису на початкових етапах інкубації, в цьому разі рівень гемолізу клітин значно знижується протягом усього періоду інкубації. Згідно з даними [2, 6], модифікація еритроцитів ПХМБ зумовлює зміни зв'язку мембрана - цитоскелет в ділянці білка смуги 3-анкірин-спектрин. Дія цього реагенту виявляється під час зв'язування його з SH-групою, що локалізована на 17 кДа гідрофобному фрагменті білка смуги 3. Водночас ПХМБ інгібує і осмотичні, і дифузійні потоки води внаслідок взаємодії з сульфгідриль­ними групами білків, що асоційовані з водними каналами [13]. Це впливає на швидкість і глибину процесу гіпотонічного лізису, що може пояснювати зниження осмотичної лам­кості еритроцитів, модифікованих цим реагентом.

Комбінована обробка клітин IAA/ПХМБ (див. рис. 1) сприяє значному підвищенню чутливості еритроцитів до гіпотонічного лізису. Максимальне збільшення гемолізу клітин простежується за концентрації 75 ммоль/л NaCl, тоді рівень лізису становить близько 65% (3% в контролі). Така обробка еритроцитів підвищує показники порогової концентрації та індексу осмотичної ламкості, що дорівнюють 120 та 80 ммоль/л NaCl, відповідно. Зазначи­мо, що попередня модифікація еритроцитів IAA забезпечує насичення цитоплазматичного пулу сульфгідрильних груп і частки SH-груп мембрани, внаслідок чого ПХМБ не блокує цих груп, а має змогу взаємодіяти з ПХМБ-специфічними сульфгідрильними групами білка смуги 3 [6]. Така обробка приводить до зміни конформації цитоплазматичного домену біл­ка смуги 3, у цьому разі порушується його асоціація з анкірином у цитоскелеті [6]. Це ініціює створення кластерів білка на початковій стадії гіпотонічного лізису [9, 10], що при­водить до збільшення чутливості клітин, модифікованих IAA/ПХМБ, до гіпотонічних умов. Відомо, що попередня обробка еритроцитів ацетазоламідом інгібує вихід аніонів

Таблиця 1

Значення порогових концентрацій та індексів осмотичної ламкості еритроцитів людини, модифікованих ацетазоламідом та за наявності гідрокарбонату натрію

Модифікація еритроцитів

Порогова концентрація, ммоль/л

Індекс осмотичної ламкості, ммоль/л

Контроль

67,5

65

Ацетазоламід

85

70

ідрокарбонат натрію

65

60


Таблиця 2

Значення порогових концентрацій та індексів осмотичної ламкості еритроцитів людини,

модифікованих хлоридом алюмінію

Модифікація еритроцитів AlCl3, мкмоль/л

Порогова концентрація, ммоль/л

Індекс осмотичної ламкості, ммоль/л

Контроль 100 300 500

67,5 90

105

150

65

65 70

75

хлору i протонів в обмін на надходження в клітину гідрокарбонату, що зумовлено блоку­ванням циклу Якобса - Стеварта [3, 11]. У табл. 1 наведено результати дослідження гіпо­тонічного лізису еритроцитів, модифікованих ацетазоламідом (інгібітор карбоангідрази), а також за наявності гідрокарбонату натрію (субстрат карбоангідрази). Попередня оброб­ка еритроцитів ацетазоламідом значно підвищує рівень гемолізу, у цьому випадку зна­чення порогової концентрації зростає до 85 ммоль/л NaCl, а індекс осмотичної ламкості модифікованих клітин збільшується до 70 ммоль/л NaCl. За наявності гідрокарбонату натрію в гіпотонічних середовищах простежується зменшення показника порогової кон­центрації до 65 ммоль/л NaCl, а також індексу осмотичної ламкості до 60 ммоль/л NaCl. Отже, інгібування циклу Якобса - Стеварта шляхом обробки клітин ацетазоламідом зу­мовлює підвищення чутливості еритроцитів людини до гіпотонічного лізису, тоді як на­явність у середовищі інкубації субстрату карбоангідрази й активація цього циклу сприяє підвищенню стійкості клітин до дії гіпотонічних умов. Як бачимо, чутливість еритро­цитів людини до гіпотонічного лізису значно залежить від функціонування циклу Якоб-са - Стеварта.

Модифікація еритроцитів хлоридом алюмінію приводить до значного зменшення їхньої осмотичної стабільності (табл. 2). Зі збільшенням концентрації модифікатора збі­льшуються значення порогової концентрації NaCl, за якої реєструють 10% лізис клітин, і в разі використання 500 мкмоль/л AlCl3 цей рівень ушкодження простежується за ізотоні­чних умов (150 ммоль/л NaCl). Зазначимо, що показник індексу осмотичної ламкості ери­троцитів також зсувається в бік зростання концентрації солі й досягає 75 ммоль/л NaCl у випадку модифікації клітин з 500 мкмоль/л AlCl3. Відомо, що хлорид алюмінію суттєво впливає на ліпідний матрикс мембрани еритроцитів унаслідок взаємодії переважно з зов­нішнім моношаром [12], а також значно знижує плинність мембранних ліпідів [5]. Підви­щення жорсткості мембрани за такої модифікації приводить до зниження швидкості замикан­ня мембранних дефектів на етапі гіпотонічної інкубації [9], що виявляється у збільшенні осмо­тичної ламкості еритроцитів.

Отже, зміна структурно-функціонального стану еритроцитів під дією модифікато­рів зумовлює значну модуляцію чутливості клітин до гіпотонічного лізису. У цьому разі характер і глибина впливу модифікатора на осмотичну стабільність клітин залежить від його хімічної природи і механізму взаємодії з клітинними структурами. В умовах моди­фікації чутливість еритроцитів до гіпотонії визначена структурною цілісністю цитоске-лет-мембранного комплексу, а також функціонуванням систем транспортування іонів.

1. Рамазанов В. В. Влияние осмотического стресса и модификаторов цитоскелета на развитие холодового и гипертонического шока эритроцитов: Дисс. ... канд. биол. наук. Харьков, 1993. 138 с.

2. Clark S. J., Ralston G. B. The dissociation of peripheral proteins from erythrocyte mem­branes brought about by p-mercuribenzenesulfonate // Biochim Biophys Acta. 1990. Vol. 1021. P. 141-147.

3. Geers C., Gros G. Carbon dioxide transport and carbonic anhydrase іп blood and mus­cle // Phisiol. Rev. 2000. Vol. 80. N 2. P. 681-715.

4. Haest C. W. M., Kamp D., Deuticke B. Topology of membrane sulfhydryl groups іп the human erythrocyte. Demonstration of a non-reactive population іп intrinsic proteins// Biochim. Biophys. Acta. 1981. Vol. 643. P. 219-326.

5. King R. G., Sharp J. A., Boura A. L. The effect of Al3+, Cd2+ and Mn2+ on human erythro­cyte chotine transport // Biochem. Pharmacol. 1983. Vol. 32. N 23. P. 3611-3617.

6. Ralston G. B., Crisp E. A. The action of organic mercurials on the erythrocyte mem­brane // Biochim. Bk)phys. Acta. 1981. Vol. 649. P. 98-104.

7. Ramjeesingh M., Gaarn A., Rothstein A. The locations of the three cysteine residues іп the primary structure of the intrinsic segments of band 3 proteins, and implications con­cerning the arrangement of band 3 protein in the bilayer // Biochim. Biophys. Acta. 1983. Vol. 729. P. 150-160.

8. Ramjeesingh M., Gaarn A., Rothstein A. The sulfhydryl groups of the 35000-dalton c-terminal segment of band 3 are located in a 9000-dalton fragment produced by chemotro-pism treatment of the red cell ghosts // J. Bioenerg. Biomembr. 1981. Vol. 13. N 5-6. P. 411-423.

9. Sato Y., Yamakose H., Suzuki Y. Mechanism of hypotonic hemolysis of human erythro­cytes // Biol. Pharm. Bull. 1993. Vol. 16. N 5. P. 506-512.

10. Sato Y., Yamakose H., Suzuki Y. Participation of band 3 in hypotonic hemolysis of human erythrocytes // Biol. Pharm. Bull. 1993. Vol. 16. N 2. P. 188-194.

11. Sterling D., Reithmeier R., Casey J. Carbonic anhydrase: in the driver's seat for bicar­bonate transport // JOP. J. Pancreas. 2001. Vol. 2. N 4. P. 165-170.

12. SuwalskyM., Ungerer B., Villena F. et all. Effects of alCl3 on toad skin, human erythro­cytes, and model cell membranes // Brain Res. Bull. 2001. Vol. 55. N 2. P. 205-210.

13. Toon M. R., Solomon A. K. Control of red cell urea and water permeability by sulfhydryl reagents // Biochim. Biophys. Acta. 1986. Vol. 860. P. 361-375.

HYPOTONIC LYSIS OF MODIFIED HUMAN ERYTHROCYTE

N. Pisarenko, N. Danilenko, V. Martinenko

V. N. Karazin Kharkiv National University Svobody sq., 4, Kharkiv 61077, Ukraine

The effect of modifiers on the osmotic stability of human erythrocytes was investigated. It was established, that the character and vector of the devel­opment of hypotonic lysis depend on the nature of modifier and mechanisms of its interaction with cells structures. The sensitivity of human erythrocytes to the change in the medium osmotic condition is controlled by the state of the cy-toskeleton-membrane complex, the functioning of the anion carrier and the Ja­cobs-Stewart cycle.

Key words: hypotonic lysis, modifiers, human erythrocytes.

Стаття надійшла до редколегії 24.12.05 Прийнята до друку 5.04.06

Страницы:
1 


Похожие статьи

Н Писаренко, Н Даниленко, В Мартиненко - Гіпотонічний лізис модифікованих еритроцитів людини