Т І Чорна - Депокерований вхід са2+ у секреторні клітини слинних залоз личинки drosophila melanogaster - страница 1

Страницы:
1  2  3  4 

УДК612.313:577.352.468

ДЕПОКЕРОВАНИЙ ВХІД Са2+ У СЕКРЕТОРНІ КЛІТИНИ СЛИННИХ ЗАЛОЗ ЛИЧИНКИ Drosophila melanogaster

Т. І. Чорна1,2, Г. Хасан2, В. В. Манько1

''Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського, 4, Львів 79005, Україна e-mail: tanya0104@yandex.ru; vvmanko@gmail.com

2Національний Центр Біологічних Наук, Тата Інститут ФундаментальнихДосліджень, м. Бангалор, Індія

З використанням конфокальної мікроскопії зареєстровано депокерований вхід Са2+ у секреторні клітини слинних залоз личинки лінії Drosophila melanogaster, яка селективно експресує Са2+-сенсор G-CaMP1.6. Для вивільнення іонів Са2+ із внутрішньоклітинних депо використовували Са2+-іонофор іономіцин або блока-тор Са2+-помпи ендоплазматичного ретикулуму тапсигаргін. Додавання цих речо­вин до безкальцієвого середовища спричиняло незначне і нетранзієнтне зростан­ня концентрації цитозольного Са2+ у секреторних клітинах. Внаслідок збільшення позаклітинної концентрації Ca2+ до 2 ммоль/л відбувалося значне зростання рівня цитозольного Са2+ в обох випадках. Але за використання іономіцину зростання ци­тозольного Са2+ у всіх випадках було транзієнтним, причомуСа*+-індуковані Са2+-транзієнти від різних клітин фрагмента залози були синхронними і зумовлювались, очевидно, як активацією депокерованого входу Са2+, так і його надходженням із позаклітинного середовища внаслідок іонофоретичного обміну. У разі спустошен­ня депо тапсигаргіном збільшення позаклітинної концентрації Са2+ у частині клітин спричиняло швидкі транзієнти цитозольного Са2+, у частині - повільні транзієнти, які змінювалися нетранзієнтним зростанням рівня цитозольного Са2+, а в частині -лише нетранзієнтне зростання рівня цитозольного Са2+. Такі відмінностіСа^-інду-кованих Са2+-транзієнтів у різних клітинах за використання тапсигаргіну зумовлені, мабуть, тим, що у їх генеруванні беруть участь не лише депокеровані Са2+-канали, а й інші Са2+-транспортувальні системи плазматичної мембрани і внутрішньоклі­тинних органел.

Ключові слова: секреторні клітини, слинні залози, депокерований вхід Са2+, Са2+-транзієнти, іономіцин, тапсигаргін, Drosophila melano­gaster, конфокальна мікроскопія.

ВСТУП

В електрично незбудливих клітинах надходження іонів Са2+ є необхідним для регулювання багатьох процесів, зокрема експресії генів, росту клітин і їх проліфе­рації, екзоцитозу, апоптозу тощо. Основним шляхом надходження Са2+ у ці кліти­ни, як вважають, є депокерований, або ємнісний [20], при якому спустошення вну­трішньоклітинних депо Са2+ активує Са2+-канали плазматичної мембрани [23]. Зна­чним поштовхом у з'ясуванні механізмів регулювання цих каналів і ролі у різнома­нітних фізіологічних процесах було нещодавнє відкриття важливих компонент де-покерованого входу Са2+ - білків Stim [12, 25] та Orai [7].

Stim (stromal interacting molecule) - це трансмембранний білок, який віді­грає роль своєрідного Са2+-сенсора ендоплазматичного ретикулуму. Причому у Drosophila melanogaster експресується тільки один ген Stim, тоді як у ссавців -два (Stiml і Stim2) [23].

Трансмембранний білок Orai є компонентою Са2+-каналу плазматичної мемб­рани, який активується вивільненням Са2+ іздепо (CRAC-каналу). У Drosophila він кодується геном olf186-F [25], а у людини три ізоформи цього білка (Orai1, Orai2, Orai3) кодуються трьома генами - ТМЕМ142А, ТМЕМ142В, ТМЕМ142С [9].

Попередніми дослідженнями із використанням генспецифічних праймерів було показано експресію гена olf186-F у слинних залозах личинки Drosophila [4]. Це може свідчити про важливе значення депокерованого входу іонів Са2+ у секреторних кліти­нах слинних залоз личинки дрозофіли для підтримання Са2+-гомеостазу. Проте не­обхідно отримати функціональне підтвердження цього припущення, що було осно­вною метою наших досліджень із застосуванням методів конфокальної мікроскопії.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Дослідження проведені на слинних залозах личинок лінії Drosophila melanogaster, яка селективно експресує Са2+-сенсор - G-CaMP1.6 у секреторних клітинах. Для цього провели таке схрещування:

8 C155 Gal4 х ? UAS-G-CaMP1.6.

G-CaMP1.6 [18] - це вдосконалений класичний G-CaMP, до складу якого вхо­дить молекула білка cpGFP, кальмодулінзв'язуючий пептид М13 (фрагмент кінази легкого ланцюга міозину) та кальмодулін [17]. Його флуоресценція єу40 разів ви­щою завдяки, головним чином, підвищенню квантового виходу. G-CaMP1.6 експре­сується у цитоплазмі, володіє порівняно із класичним G-CaMP вищою афінністю до іонів Са2+ (Kd=146 нмоль/л, коефіцієнт Хілла - 3,8, Fmax/Fmin=4,9) та меншою чут­ливістю до рН середовища [18].

Дрозофілу вирощували на стандартному поживному декстрозному середови­щі при температурі 22-25°С. Слинні залози виділяли із личинок третього віково­го періоду у розчині, що містив (ммоль/л): NaCl - 150, KCl - 5, CaCl2- 1, MgCl2- 1, HEPES - 20, сахароза - 3,55; pH 7,2. В експериментах також використовували без-кальцієвий розчин, у якому 1 ммоль/л CaCl2 еквімолярно заміняли на MgCl2 і до­давали ЕГТА до кінцевої концентрації 1 ммоль/л. Для інгібування Са2+-помпи ен­доплазматичного ретикулуму використовували тапсигаргін (Sigma) у концентрації 10 мкмоль/л. Пасивне спустошення внутрішньоклітинних депо викликали також використанням 10 мкмоль/л іономіцину (Sigma).

Після виділення слинні залози поміщали у чашки Петрі з вихідним або безкаль-цієвим розчином і закріпляли їх у штативі інвертованого мікроскопа (Olympus, Japan).

Са2+-залежні зміни флуоресценції білка G-CaMP1.6 після обробки слинних залоз іо-номіцином і тапсигаргіном досліджували за допомогою конфокального лазерного ска­нуючого мікроскопа Olympus Fluoview1000 (Olympus, Japan), використовуючи об'єктив 10x/NA 0.4, або Yokogawa spinning disс - Andor&Olympus (Yokogawa/Andor/Olympus, Japan) зі застосуванням об'єктива 20x/NA0,7. В обох випадках як джерело збуджуючо­го світла (довжиною 488 нм) використовували багатохвильовий аргоновий лазер. До­вжина хвилі флуоресцентного випромінювання була у межах 510-520 нм.

Протягом кожного з експериментів у полі зору фокусували ділянку залози, що складалася приблизно із 10-15 клітин, і сканували її у часі: 3-5 хв - у контролі, а після додавання іономіцину, тапсигаргіну або СаС!2 - ще 20 хв. Результати отрима­ли у вигляді серії зображень сфокусованого фрагмента залози зі змінами її флуо­ресценції протягом усього часу. Загальний час інкубування не перевищував 45 хв. Кожний експеримент серії повторювали 3-7 разів.

Аналіз отриманих зображень проводили з використанням програмного забез­печення FV10-ASW1.3 (для Olympus Fluoview1000) та Andor iQ1.8.1 (для Yokogawa spinning disk - Andor&Olympus), беручи до уваги інтенсивність флуоресценції як від фрагмента залози, так і від окремих клітин.

Для того, щоб з'ясувати природу висхідної і низхідної частин піку, отриманого внаслідок заміни вихідного безкальцієвого розчину Са2+-вмісним, ми порівняли швид­кість його наростання і спадання. Для розрахунку швидкості наростання і спадання транзієнта амплітуду його висхідної або низхідної частини (в ум. од.) ділили на її три­валість (у с).

Статистичне опрацювання даних здійснювали з використанням програмного пакета для персональних комп'ютерів Мicrosoft Excel, достовірність змін визнача­ли за t-критерієм Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ І ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

Методичним підходом для активації депокерованого входу Са2+ у клітини є спусто­шення його внутрішньоклітиннихдепо [19]. Цього можнадосягнути різними шляхами:

1) фізіологічно - за рахунок підвищення рівня інозитол-1,4,5-трифосфату (ІФ3) [20], або

2) шляхом його пасивного спустошення - з використанням інгібіторів актив­ного транспорту Са2+ в ендоплазматичного ретикулум тапсигаргіну, цикло-піазонієвої кислоти чи 2,5-тетра-бутилгідроксихінону [19].

Са2+-іонофори, зокрема A23187 та іономіцин, також можуть бути використані з метою пасивного спустошення внутрішньоклітинних депо Са2+, хоча спричиню­ють надходження іонів Са2+ у клітину і через плазматичну мембрану за принципом електронейтрального Са2+/2Н+-обміну [6]. Іономіцин з цією метою було використано у багатьох незбудливих клітинах: в ацинарних клітинах підшлункової залози мишей [10], у лінії клітин молочної залози та клітин раку підшлункової залози, базофіль-ної лейкемії щурів [3] і в HeLa-клітинах [5]. Тому на першому етапі ми зосередили свої зусилля на дослідженні можливості використання іономіцину для спустошен­ня внутрішньоклітинних депо секреторних клітин слинних залоз личинки Drosophila. Для цього слинні залози личинки спочатку інкубували у безкальцієвому середовищі протягом 5хв, після чогоїхобробляли іономіцином. Інкубування продовжували ще 20 хв, одночасно скануючи сфокусовану ділянку однієї з них. На рис. 1, Б представ­лено зміну інтенсивності флуоресцентного сигналу, отриманого від фрагмента за­лози (1) та окремих клітин цього фрагмента (2) до і після обробки іономіцином.

А

2500

2000

1500

1000

500

***

□ 0Са2+

□ Іономіцин ■ 2Са2+

4000 3500 3000

2500 2000 1500 1000

500 -

і Іономіцин

2Са2+

300

600

900

1200 1500

Час, с

1800

2100

2400

2700

Рис. 1. Активація депокерованого входу Са2* у секреторні клітини слинних залоз личинки Drosophila melanogaster за використання іономіцину: А - конфокальні фотографії фрагмента залози (а -у контролі; б-після обробки іономіцином; в, г, д, е-після збільшення [Са2*]е до 2 ммоль/л); Б-Са2*-сигнали, зареєстровані від цього фрагмента (1) і його 10-ти окремих клітин (2); В-зміна вмісту ци­тозольного Са2*у секреторних клітинах за дії іономіцину і збільшення позаклітинної[Са2*]; [Ca2*]e = 0

1 2 ммоль/л відповідно, [іономіцин] = 10 мкмоль/л; ** - різниця порівняно з контролем достовір-наз Р < 0,01;***-з Р < 0,001,n = 30

Fig. 1. Activation of the store-operated Ca2* entry into the secretory cells of Drosophila melanogaster larval salivary glands under the use of ionomycin: A - confocal images of gland's region (a - in control; б-afterionomycin treatment; в, г, д, е - after increase of [Са2*]еЬэ 2 mmol/l); Б - Ca2*-signals, registered from this portion (1) and from its 10 cells separately (2); B - change of the cytosolic Ca2* content in the secretory cells under the influence of ionomycin and increase of extracellular [Ca2*]; [Са2*]е= 0 and

2 mmol/l respectively, [ionomycin] = 10 ^imol/l; ** - difference is significant compare to the control with Р < 0,01; *** - with Р < 0,001,n = 30

В

0

Б

0

0

Як видно, внаслідок аплікації іономіцину спостерігається статистично досто­вірне (n = 30, Р s 0,01), але незначне і нетранзієнтне підвищення флуоресценції від 1089,55 + 26,35 до 1212,67 + 31,48 ум. од., тобто на 11% (рис. 1, В). Це підви­щення інтенсивності флуоресценції свідчить про незначне збільшення цитозоль-ної концентрації іонів Са2*. Причому таке іономіциніндуковане зростання цитозоль-ної концентрації Са2+ є наслідком, на нашу думку, вивільнення цих іонів із внутріш­ньоклітинних депо, оскільки у позаклітинному середовищі їх не було. Це припу­щення підтверджується тим, що за збільшеної позаклітинної концентрації Са2+ до 1 ммоль/л іономіцин викликав суттєвіше підвищення (п = 26, P < 0,001) вмісту ци­тозольного Са2+ - на 49% (рис. 2, А і Б). У цьому випадку індуковане іономіцином зростання флуоресценції, зареєстрованої від фрагмента залози, теж було нетран-зієнтним. Більше того, протягом 20 хв рівень цитозольного Са2+ поступово підви­щувався (рис. 2, А).

Б

З

2000

^ 1600 о.

§ 1200

а

? 800

І

а 400 і

і о

т пі Са2*

 

□ Іономіцин

 

 

 

 

 

 

 

І

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис 2. Іономіциніндуковані зміни рівня цитозольного Са2* у секреторних клітинах слинних залоз, інку-бованих у Са2*-вмісному середовищі: А - Са2*-сигнали, зареєстровані від фрагмента залози (1) та його 8-ми окремих клітин (2); Б - зміна вмісту цитозольного Са2* у секреторних клітинах за дії іономіцину; [Ca2*]e = 1 ммоль/л, [іономіцин] = 10 мкмоль/л; *** - різниця порівняно з контролем достовірна зР< 0,001,п = 26

Fig. 2. Іопотусіп-induced changes of cytosolic Са2* level in the secretory cells of salivary glands, incubated in the Ca2*-containing medium: А- Ca2*-signals, registered from gland's region (1) and from its 8 cells separately (2); Б - change of the cytosolic Ca2* content in the secretory cells under the influence of ionomycin; [Ca2*]e = 1 mmol/l; [ionomycin] = 10 umol/l; *** - difference is significant compare to the control with P < 0ДЮ1,п = 26

Страницы:
1  2  3  4 


Похожие статьи

Т І Чорна - Депокерований вхід са2+ у секреторні клітини слинних залоз личинки drosophila melanogaster