И А Харчук - Динамика компонентов биохимического состава spirulina platensis при ангидробиозе - страница 1

Страницы:
1  2 

УДК 582.232: 577.115

И. А. Х А Р Ч У К

ДИНАМИКА КОМПОНЕНТОВ БИОХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА

SPIRULINA PLATENSIS ПРИ АНГИДРОБИОЗЕ

Проведён сравнительный анализ биохимического состава клеток прокариотических микроводо­рослей S. platensis в активном состоянии, обезвоженном, в процессе хранения и после реактива­ции. Показано, что обезвоживание S. platensis сопровождается снижением свободных нуклеотидов и структурными изменениями в липопротеиновом комплексе. В процессе хранения происходит деструкция пигментного комплекса, на что указывает снижение их показателей. Однако в процес­се реактивации повреждения репарируются и клетки переходят к метаболизму.

Одной из важных задач современной биологии является надёжное сохранение культур микроводорослей и создание генетических банков штаммов. В альгологической практике применяется широкий спектр методов, позволяющих сохранять микроводорос­ли в жизнеспособном состоянии: содержание на жидких средах длительного хранения [12], агаре, альгинате [9], при помощи лиофилизации, криосохранения с использованием защитных сред и криопротекторов [1; 13]. Однако, при использовании этих методов происходит изменение морфологических и функциональных свойств, а также измельча­ние клеток сохраняемых культур. Кроме того, поддержание культур в жизнеспособном состоянии является трудоёмким процессом и требует дорогостоящего оборудования.

Как способ хранения предлагается перевод микроводорослей путём глубокого и длительного торможения метаболизма клеток в неактивное состояние, но обратимое -при благоприятных условиях среды. Достигнуть заданной цели возможно с помощью обезвоживания. Обезвоживание микроорганизмов приводит к их переходу в анабиоти­ческое состояние, при котором происходит временная обратимая приостановка процес­сов обмена веществ. В этих условиях в клетках возникает целый ряд конформационных, физико-химических и биохимических изменений и перестроек, связанных с белками, липидами, углеводами, поли фосфатами и другими соединениями.

Цель данной работы изучить изменение биохимического состава клеток про-кариотических микроводорослей в активном состоянии, обезвоженном, в процессе хра­нения и после реактивации.

Материал и методы. Объектом исследования была культура Spirulina platen­sis (штамм IBBS - 31), выращиваемая в отделе биотехнологии и фиторесурсов ИнБЮМ НАН Украины.

Цианопрокариоты культивировали в накопительном режиме, при постоянном круглосуточном освещении и автоматическом перемешивании с использованием насоса для удаления избытка кислорода из среды и равномерного прогрева всего слоя пита­тельного раствора культуры. Интенсивность света на поверхности раствора составляла 8 кЛк. Температура среды колебалась в диапазоне 20 - 25° С. В качестве питательной сре­ды использовали среду Заррук [10]. Объём среды в культиваторах составлял 2 л, при высоте слоя раствора 18 см. На стационарной фазе роста проводили концентрирование трихомов на планктонном сите 100 ПЭ [15]. Клетки промывали дистиллированной водой в соотношение 1 :3 (вода: клетки) и обезвоживали в термостате при температуре 30°С в течении 24 ч. Обезвоженные культуры хранили в герметично закрытых полиэтиленовых упаковках, в темноте при температуре 15 - 20°С. Влажность в обезвоженных культурах определяли стандартным методом доведения до постоянной массы [6].

Пробы обрабатывали по схеме комплексного химического анализа гидробио-нтов. Массовую долю белка в водоростях определяли по методике Лоури [14], содержа-

Экология моря. 2008. Вып. 76

© И. А. Харчук, 2008

67ние пигментов - спектрофотометрическими методами на приборе СФ - 2000 [16]. Хло­рофилл (ХЛ) а из сырых клеток S. platensis экстрагировали 100 % ацетоном; для расчета его концентрации использовали специфический коэффициент экстинкции равный 88,1 5 дм3 г-1 см-1 (при Х= 663 нм) [11]. В тоже время хлорофилл а и в из сухих клеток S. plat-ensis экстрагировали 90 % ацетоном; оптическую плотность полученных супернатантов регистрировали при 664 и 647 нм [16]. Каротиноиды (КР) оценивали в суммарной вы­тяжке пигментов S. platensis по поглощению в области 480 нм [16]. Общее содержание липидов находили весовым методом [6]. Количество свободных нуклеотидов (СН), РНК и ДНК определяли спектрофотометрическим методом [7]. Регистрируемые показатели химического состава выражали в пересчете на сухую массу (СМ). Влажность в обезво­женных культурах определяли стандартным методом доведения до постоянной массы

[6].

Через 1 год пребывания S. platensis в состоянии ангидробиоза изымали навес­ки для биохимического анализа и реактивации. Реактивированную культуру выращива­ли в накопительном режиме, по достижению ею стационарной стадии роста, обезвожи­вали и проводили биохимический анализ выше описанным способом.

Результаты и обсуждение. При сравнении биохимических показателей S. platensis до и после обезвоживания выявлено статистически значимое снижение со­держания СН - на 56 %, суммарных липидов - на 33 % и повышение РНК - на 40 %, бел­ков - на 33 % (рис. 1). Доля пигментов изменялась незначительно ХЛ a - на 4 %, КР - на 8 %. Данные подтверждены с помощью критерия t-Стьюдента (табл. 1).

Через 1 год хранения Spirulina platensis в состоянии ангидробиоза в биохими­ческом составе обнаружены следующие изменения по сравнению с данными после обез­воживания: снижение доли ХЛ a - на 35 %, КР - на 31 %, РНК - на 42 %, ДНК - на 65 %, свободные нуклеотиды понизились не значительно.

Анализ биохимических компонентов реактивированной культуры S. platensis, а затем повторно обезвоженной на стационарной стадии роста выявил увеличение содер­жания ХЛ a - на 30 % по сравнению с результатами до обезвоживания, РНК - на 37 % и, белков - на 36 %, а так же снижение доли КР - на 25 % и СН - на 57 %. Количество ДНК и липидов было ниже, чем до обезвоживания, но эта разница была статистически незна­чительна.

При сравнении биохимических составляющих реактивированной и вновь де­гидрированной S. platensis со значениями при закладке на хранении отмечено статисти­чески значимое увеличение содержания ХЛ a - на 25 %, снижение КР - на 1 7 %, ДНК -на 58% и белков на 9 % (табл. 1).

Сопоставление биохимических данных после реактивации с данными при хра­нении показало увлечение ХЛ a - в 2 раза, КР - 1,2 раза, РНК - в 1,7 раза, ДНК - в 1,2 раза, что свидетельствует о репарации повреждений и полном восстановлении клеток.

Таким образом, результаты проведённых исследований показали, что пиг­ментный комплекс S. platensis менее подвержен действию высоких температур, что обу­словлено строением пигментного аппарата Cyanophyta [4] и строением клеточной обо­лочки [5, 1 8]. Клеточная оболочка S. platensis по химическому составу и ультратонкому строению клеточных стенок наиболее близка к грамотрицательным бактериям, её кле­точная стенка состоит из 4 слоёв и содержит муреин (пептидогликан). Эти особенности вида способствуют повышению устойчивости организма к неблагоприятным условиям, в частности к обезвоживанию. Однако в процессе хранения происходит снижение пока­зателей пигментного комплекса, что, вероятно, связано с его деструкцией.

В процессе обезвоживания в клетках увеличивается содержание белка. В про­ведённых ранее экспериментах было обнаружено, что возрастание массовой доли белка происходит на первых стадиях обезвоживания культуры. Количество суммарныхлипидов при обезвоживании влажных трихомов S. platensis заметно уменьшается. Веро­ятно, при обезвоживании какая-то часть липидов разрушается. Эти данные указывают на изменения в липопротеиновом комплексе.

s 2,5 о

^ 2

£ 1,5

£ 0 і:;-;:;--

■І;-;:;--■І;-;:;--■І;-;:;--

■І;-;:;-­" ;!-!;-;!-!;-;!

7/ й-й-::

 

 

■WW ■WW

 

Хл

В до обезв ож

через 1 год п/обезвож

КР

после обезвож 0 реактивированная

ш 80 о

^ 60

о

1 40

га

°- 20

о

2 0

липиды

В до обезвож

В реактивированная

белки после обезвож

о

SS 6

S

« 4 о.

о 2

о о

0

о

-+■— s-s-s

0,2 0,16 0,12 0,08 0,04

0

СН

РНК

ДНК

в до обезвож

через 1 год п/обезвож

после обезвож      И до обезвож после обезвож

реактивированная  □ через 1 год п/обезвож В реактивированная

Рисунок 1. Содержание компонентов сухой массы Spirulina platensis до и после обезвожива­ния, через 1 год после обезвоживания и в реактивированной культуре (доверит. интервал, при Р = 0,95)

Figure 1. The ingredient of components of dry weight Spirulina platensis before and after a dehydra­tion, in 1 year after a dehydration and in reactivate to culture (will entrust. an interval, at Р = 0,95)

Известно, что липиды - самые эффективные источники сохранения энергии, они являются структурными элементами большинства клеточных мембран. Биологиче­ские мембраны в качестве динамически организованных надмолекулярных систем непо­средственно участвуют в обмене веществ, энергии и информацией, как между внутри­клеточными структурами, так и между клеткой и внешней средой [2]. Динамические свойства мембраны обусловлены подвижностью её молекулярной организации. Белки и липиды взаимосвязаны в мембране непостоянно и образуют подвижную, гибкую, вре­менно связанную в единое целое структуру, способную к структурным перестройкам. Молекулярные   сдвиги   и   структурные   перестройки   в   молекулах мембранных

8

компонентов оказывают глубокое влияние на все формы функциональной активности биологических мембран. Под действием стрессорных факторов увеличивается уровень перекисного окисления липидов, что ведёт к изменениям количественных и качествен­ных характеристик мембран. Нарастает скорость процессов гидролиза, и тормозится синтез белка.

Таблица 1. Критерий t - Стьюдента для различных биохимических компонентов Spirulina platensis при t 0 5= 2,781

Table 1. Criterion t - Student for various biochemical components Spirulina platensis at t 0 5 = 2,781

Биохими­ческие компонен­ты

До и

после обезво­живания

После обезво­живания и через 1 год хранения

До обезвожи­вания и реакти­вированная

После обезво­живания и ре­активированная

Через 1 год хранения и реактивиро­ванная

ХЛ

0,855

7,25*

8,01*

7,15*

16,08*

КР

2,04

6,01 *

4,76*

3,13*

2,25

СН

5,87*

1 ,77

4,64*

0,86

0,89

РНК

4,22*

1 3,82*

3,79*

0,94

1 2,0*

ДНК

2,25

5,64*

1,58

1 2,5*

0,42

Липиды

2,94*

 

2,1 2

0,82

 

Белок

59,25*

 

18,08*

5,91*

 

*- статистически значимые изменения

Наряду с ограничением скорости синтеза белка, в целом, возможно усиление синтеза стрессовых белков. Возрастание активности гидролитических процессов ведёт к накоплению стрессовых метаболитов, например, таких низкомолекулярных осмотически активных соединений, которые способны образовывать гидрофильные коллоиды, что защищает белки от денатурации при засухе или высокой температуре [2, 8].

При исследовании нуклеинового комплекса отмечено, что основные измене­ния его биохимических составляющих происходят во время обезвоживания влажных клеток. Так, количество свободных нуклеотидов снижалось при переводе культуры в состояние ангидробиоза, и оставалось постоянным в течение пребывания культуры в обезвоженном состоянии. Практически одинаковые величины свободных нуклеотидов в обезвоженной культуре и реактивированной, а затем повторно обезвоженной указывает на идентичные изменения в клетках при их дегидратации. Содержание дезоксирибонук-леиновых кислот в клетках, за исключением периода деления, весьма постоянно [7]. ДНК - более устойчивая и стабильная структура, чем РНК, что обусловлено её строени­ем. Содержание рибонуклеиновых кислот изменяется в зависимости от фазы роста, ин­тенсивности биосинтетических процессов в клетках и т.д. Нами зарегистрировано по­вышение РНК после обезвоживания, как при первом, так и вторичном, в реактивирован­ной культуре. Доля РНК возрастала, вероятно, из-за разрушения свободных нуклеоти-дов. Согласно [3], сохранение жизнеспособности после обезвоживания зависит от со­стояния белоксинтезирующего аппарата, вернее, содержания РНК, которое должно быть не менее 60 % первоначального. У S. platensis его количество не понижалось ниже 60 % при всех способах обезвоживания.

Результаты биохимического анализа реактивированной культуры показывают, что после длительной реактивации клетки восстанавливаются, возобновляется их мета­болизм. Во время реактивации происходит репарация не только клеточных элементов, но и биохимических процессов. Длительность восстановления зависит от степени повре­ждений при обезвоживании и хранении. При отсутствии повреждений переход к фотосин­тезу и делению занимает относительно короткий промежуток времени.

Заключение. Обезвоживание S. platensis сопровождается снижением свобод­ных  нуклеотидов  и  структурными  изменениями  в  липопротеиновом комплексе.

В процессе хранения происходит деструкция пигментного комплекса, на что указывает снижение их показателей. Однако в процессе реактивации повреждения репа-рируются и клетки переходят к метаболизму.

1. Айздайчер Н. А. Жизнеспособность морских микроводорослей в зависимости от условий хранения : автореф. дис. на соиск. науч. степени канд. биол. наук : спец. 03.00.18 «Гидро­биология» / Н. А. Айздайчер - Владивосток., 1988. - 19 с.

2. Антонов В. Ф. Липидные поры: стабильность и проницаемость мембран / В. Ф. Антонов // Соросовский образовательный журн. - 1998. - № 10. - С. 10-17.

3. Бекер М. Е. Живая клетка и ее жизнедеятельность / М. Е. Бекер, Е. П. Райпулис // Биотехно­логия [под ред. М. Е. Бекер, Г. К. Лиепиньш, Е. П. Райпулис] - М. : ВО Агропромиздат,

1 990. - С . 7-41 .

4. Гусев М.В. Сравнительная физиология синезелёных водорослей //Успехи микробиологии. -1966. - № 3. - С. 74 - 103.

5. Кондратьева Н.В. Строение клеточных покровов Cyanophyta (Обзор литературных данных) / Н.В. Кондратьева // Альгология. - 1993. - 3, № 3. - С. 96-109.

6. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической прак­тике. - Киев: Наукова думка, 1 975. - 247 с.

7. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот / А. С. Спирин // Биохимия. - 1 958. - 23, № 5. - С. 656-662.

8. Чиркова Т. В. Клеточные мембраны и устойчивость растений к стрессовым воздействиям / Т. В. Чиркова // Соросовский образовательный журн. - 1997. - № 9. - С. 12-17.

9. Chen Y. C. Immobilized Isochrysis galbana (Haptophyta) for long-term storage and applications for feed and water quality control in clam (Meretrix lusoria) cultures / Y. C. Chen // Journ. of Appl. Phycol. - 2003. - 15, № 5. - P. 439-444.

10. Faucher O. Utilization of scawater - urea as a culture medium for Spirulina maxima / O. Faucher, B. Coupal, A. Leduy // Can Journ. Microbiol. - 1979. - 25, № 6. - P. 752-759.

11. Jeffrey S.W. New spectrophotometric equations for determining chlorophylls a, b, c1, and c2 in higher plants, algae and natural populations / S.W. Jeffrey, G.F Humphrey // Biochem. Physiol. Planten. - 1975. - 167. - P. 191-194.

1 2. Marsalek B. Long-tem maintenance of alga strains for use in biomassays and biotechnology / B. Marsalek, R. Rojickova-Padrtova // Arch. Hydrobiol. Suppl. Algol. Stud. - 1988. - 124. - Р. 121­1 36.

1 3. Poncet J-M. Cryopreservation of the unicellular marine alga, Nannochloropsis oculata / Poncet J-M, Veron Beno'it. // Biotechnology Letters. - 2003. - 25, № 23. - Р. 2017 - 2022

1 4. Protein measurement with folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Faar [et all] // J. Biol. Chem. - 1951. - 193, № 1. - P. 265-275.

1 5. Quatitative assessment of the major limitations on productivity of Spirulina platensis in open raceways / A. Richmond, E. Lichtenberg, B. Stahl [et all] // J. Appl. Phycol. - 1990. - 2, № 3. - Р.

1 95-206.

16. Rowan K. S. Photosynthetic Pigments of Algae / K. S. Rowan // Cambridge : Cambridge Univ. Press, 1989. - 334 p.

Институт биологии южных морей НАН Украины,

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

И А Харчук - Анабиоз основные понятия и сопровождающие его процессы

И А Харчук - Динамика компонентов биохимического состава spirulina platensis при ангидробиозе

И А Харчук - Жизнеспособность dunaliella salina в зависимости от условий обезвоживания и длительности хранения в состоянии ангидробиоза

И А Харчук - Химический состав красной микроводоросли porphyridium purpureum при переводе в состояние ангидробиоза