Н М Дробик - Динаміка ростових та біосинтетичних характеристик культури тканин gentiana acaulis l - страница 1

Страницы:
1  2 

БІОТЕХНОЛОГІЯ

УДК 577.127: 582.923.1 + 58.085 Н. М. ДРОБИК

Тернопільський національний педагогічний університет ім. Володимира Гнатюка вул. М. Кривоноса, 2, Тернопіль, 46027

ДИНАМІКА РОСТОВИХ ТА БІОСИНТЕТИЧНИХ ХАРАКТЕРИСТИК КУЛЬТУРИ ТКАНИН GENTIANA ACAULIS L. ТА GENTIANA LUTEA L._

Досліджено динаміку приросту біомаси стабільних калюсних культур кореневого походження Gentiana acaulis L. і Gentiana lutea L. та синтезу в них флавоноїдів і ксантонів протягом пасажу. Виявлено взаємозв'язок між проліферацією культури тканин, вмістом у них біологічно активних речовин та умовами культивування in vitro. Доведено, що підібране живильне середовище сприяє як приросту біомаси, так і синтезу флавоноїдів і ксантонів. Встановлено розмежованість цих процесів у часі та зворотну залежність між ними.

Ключові слова: Gentiana acaulis L., Gentiana lutea L., культура тканин рослин, приріст біомаси, флавоноїди і ксантони

Культура клітин і тканин in vitro у даний час знаходить застосування у широкому діапазоні біологічних досліджень [6, 7, 9]. Важливою особливістю культивованих клітин є їхня здатність утворювати клітинну біомасу і накопичувати продукти метаболізму. При цьому в культивованих клітинах, які не перебувають під контролем розвитку цілісного організму, шляхи метаболізму можуть відрізнятися від процесів, властивих самій рослині. Для більшості культур характерний нижчий, порівняно з інтактними рослинами, рівень синтезу вторинних сполук, що робить їх вирощування економічно не вигідним. Однак, оптимізація умов вирощування in vitro неорганізовано проліферуючих клітин може привести до значного збільшення продуктивності культури з необхідним комплексом метаболітів [6, 9].

Зважаючи на фармакологічну цінність представників роду Gentiana флори України і зменшення їхньої чисельності, спричинене різними, у тому числі антропогенними чинниками, а також складну біологію та фрагментарність досліджень цих рослин, раніше нами отримані культури тканин семи видів тирличів та досліджено їхніх фізіолого-біохімічні особливості [3,

4, 13].

Однак, відомо, що у багатьох випадках культури тканин рослин накопичують вторинні метаболіти в значних кількостях лише при сповільненні або зупинці росту клітин, хоча у деяких випадках синтез продукту сприяє росту клітин [6, 10]. Приріст біомаси та рівень біосинтезу часто пов'язані зворотною кореляцією. Інколи спостерігається накопичення продуктів вторинного метаболізму в клітинах на стаціонарній фазі кривої росту [14]. Тому для одержання специфічного продукту при періодичному вирощуванні необхідно було підібрати оптимальні умови як для приросту біомаси, так i для біосинтезу та накопичення біологічно активних речовин (БАР). Важливою умовою ефективності отриманих культур in vitro є збереження ними здатності до синтезу БАР впродовж тривалого часу.

Метою даного дослідження було вивчення динаміки ростових та біосинтетичних параметрів стабільних калюсних культур кореневого походження G. acaulis та G. lutea.

Матеріал і методи досліджень

У роботі використовували культури тканин G. acaulis та G. lutea. Калюси були отримані з кореневих  експлантів  рослин  G. acaulis  з  туркульської  (г. Туркул,  хребет Чорногора, ISSN 2078-2357. Наук. зап. Терноп. нац. пед. ун-ту. Сер. Біол., 2011, № 1 (46) 37

Закарпатська обл., 1750 м.н.р.м) та G. lutea з трояської (г. Трояска, хр. Свидовець, Закарпатська

обл., 1695 м н. р. м.) популяцій. Умови отримання та вирощування калюсів G. acaulis та G. lutea

описано в роботі [3]. Тривалість пасажу калюсів становила 4 тижні.

Індекс росту (ІР) за сухою масою калюсу та вміст флавоноїдів і ксантонів визначали у

стабільних сформованих калюсах кореневого походження G. acaulis - на 33 та G. lutea - на 26

пасажах через кожні 5 діб впродовж 45 діб культивування. Індекс росту (відносний приріст

сухої маси калюсу) за сухою масою калюсу визначали за формулою:

M - от-ГР = - ,

m

де ІР - індекс росту за сухою масою калюсу, M - маса калюсу через кожні 5 діб, m -початкова маса калюсу.

Сумарний вміст флавоноїдів і ксантонів у досліджених зразках визначали як описано в [1, 12].

Отримані результати відносного приросту біомаси та кількісного визначення суми флавоноїдів і ксантонів опрацьовували статистично [8].

Результати досліджень та їх обговорення

У результаті нами досліджено динаміку фізіолого-біохімічних характеристик стабільних калюсних культур кореневого походження G. acaulis та G. lutea.

G. acaulis. Дослідження кореневого калюсу G. acaulis показало, що протягом 20 діб пасажу відбувається зменшення синтезу ксантонів порівняно з першим днем (рис. 1). Вміст флавоноїдів на 5-ту добу був досить високим, проте вже на 10-ту добу цей показник зменшувався у 2,5 раза, тоді як індекс росту за сухою масою протягом цього періоду збільшувався в 1,7 раза. З 15-ї по 35-ту добу вміст флавоноїдів практично не змінювався порівняно з 10-ю добою, і залишався невисоким. У той же час з 10-ї по 15-ту добу відбувався найбільш інтенсивний ріст калюсу: його ІР за сухою масою на 15-ту добу був максимальний і становив 1,1. Показники вмісту ксантонів і флавоноїдів дещо збільшувалися на 30-ту добу культивування, тоді як приріст біомаси калюсу в цей час порівняно з 15-ю добою зменшувався в 1,6 раза. Після 30-ї доби ріст калюсу продовжував сповільнюватися: його ІР за сухою масою становив 0,6-0,7, у той час як на 40-у добу культивування показники вмісту ксантонів і флавоноїдів у дослідженому калюсі були найвищими і складали 3,52 % і 4,77 % відповідно. Приріст калюсу на 40-у добу порівняно з 15-ю зменшувався в 1,8 раза [11].

Порівнюючи динаміку накопичення БАР у калюсній культурі із динамікою приросту біомаси калюсу (рис. 1), слід відзначити зворотну залежність: коли приріст біомаси зменшується - вміст БАР збільшується, що часто спостерігається в культурах тканин [6]. Очевидно, в даному випадку на 40-у добу культивування ріст калюсу G. acaulis сповільнюється, а весь потенціал спрямовується на синтез вторинних метаболітів.

Рис. 1. Динаміка приросту біомаси в культурі тканин G. acaulis (туркульська популяція) протягом 33-го пасажу та синтезу в ній ксантонів і флавоноїдів: 1 -ксантони, %; 2 - флавоноїди, %; 3 - індекс росту за сухою масою

Порівняння отриманих результатів вмісту БАР в калюсі G. acaulis та дикорослих рослинах показало високу активність синтезу ксантонів і флавоноїдів в культурі in vitro. Вміст флавоноїдів у калюсній культурі перевищував такий у коренях рослин G. acaulis з туркульської популяції в 3,9 раза, з реберської - в 2,9 раза, а також у надземній частині рослин реберської популяції - у 2,1 раза, однак був дещо нижчий, ніж у надземній частині рослин туркульської популяції (рис. 2, а).

а б

Рис. 2. Сумарний вміст флавоноїдів (а) та ксантонів (б) у зразках G. acaulis з реберської і туркульської популяцій: 1 - пагони рослин; 2 - кореневище і корені рослин; 3 - культура тканин 33-го пасажу (туркульська популяція)

Максимальний вміст ксантонів у калюсі кореневого походження перевищував такий не лише у коренях рослин G. acaulis з туркульської (у 4,8 раза) і реберської (у 12,2 раза) популяції, але й у надземних частинах рослин (туркульської - у 1,7 раза, реберської - у 1,3 раза) (рис. 2, б) [11], хоча у природі в надземних частинах рослин ксантонів синтезується більше, ніж у коренях

[5].

G. lutea. Дослідження стабільної культури тканин кореневого походження G. lutea показало, що протягом перших 20 діб відбувається збільшення відносного приросту сухої маси калюсу (рис. 3). Вміст флавоноїдів на 5-у добу росту був невисоким (0,38 %), на 10-у -збільшувався в 1,4 раза, на 15-у - зменшувався майже у 2,3 раза на фоні збільшення індексаросту за сухою масою калюсу. Вміст ксантонів, як і флавоноїдів, на 5-у добу був низьким (0,12 %). З 5-ї по 10-ту добу цей показник зростав у 2 рази, з 10-ї до 15-ту доби - залишався без суттєвих змін. З 15-ї до 20-ї доби вміст флавоноїдів і ксантонів практично не змінювався [2]. На 20-ту добу культивування ІР за сухою масою калюсу G. lutea був найвищим і становив 1,85, тоді як показники вмісту БАР були низькими. Починаючи з 20-ї доби вміст як флавоноїдів, так і ксантонів, зростав, досягаючи максимуму на 35-ту добу культивування - 2,34 % та 1,64 % відповідно. У той же час, на даному етапі культивування ІР за сухою масою калюсу був мінімальним. З 35-ї доби і до закінчення експерименту (до 45-ї доби) відбувалося зменшення вмісту флавоноїдів і ксантонів більше, ніж у 7 та 6 разів відповідно.

Порівнюючи динаміку накопичення БАР у калюсній культурі G. lutea із динамікою приросту калюсу (рис. 3), слід відзначити зворотну залежність - при збільшенні ІР за сухою масою, вміст флавоноїдів і ксантонів зменшується, і навпаки, що є характерним для багатьох культур.

Порівняння отриманих результатів вмісту БАР у калюсі G. lutea та дикорослих рослинах показало високу активність синтезу флавоноїдів і ксантонів в культурі in vitro.

Час, доба

Рис. 3. Динаміка приросту біомаси в культурі тканин G. lutea (трояська популяція) протягом 26-го пасажу та синтезу в ній ксантонів і флавоноїдів: 1 - ксантони, %; 2 - флавоноїди, %; 3 - індекс росту за сухою масою

їхній максимальний вміст у калюсі перевищував такий у коренях рослин G. lutea з рогнєської, пожижевської та трояської популяцій (флавоноїдів - у 5,1; 4,9 та 5,4 раза; ксантонів - у 3,8; 3 та 3,5 раза відповідно), однак був нижчим від таких показників у пагонах рослин (флавоноїдів - у 1,9; 4,2 та 2,9 раза; ксантонів - у 1,2; 2,4 та 1,7 раза відповідно) (рис. 4, а, б)

[2].

Проведені дослідження вказують на те, що підібрані умови культивування забезпечують ріст калюсів G. lutea і G. acaulis та синтез у них вторинних метаболітів. Порівняння вмісту флавоноїдів і ксантонів на 28-у добу культивування на 15-ому та 33-ому пасажах у калюсі G. acaulis та на 13-ому і 26-ому пасажах - у калюсі G. lutea показали [1, 12], що кількість цих вторинних метаболітів змінюється несуттєво, тобто в процесі тривалого культивування продуктивність залишається відносно стабільною (рис. 5).

а б

Рис. 4. Сумарний вміст флавоноїдів (а) та ксантонів (б) у зразках G. lutea з рогнєської, пожижевської та трояської популяцій: 1 - пагони рослин; 2 - кореневище і корені рослин; 3 - культура тканин 26-го пасажу (трояська популяція)

а б

Рис. 5. Сумарний вміст флавоноїдів і ксантонів у культурі тканин за різної тривалості культивування: а - G. acaulis (туркульська популяція) на 15-ому (1) і 33-ому (2) пасажах; б - G. lutea (трояська популяція) на 13-ому (1) і 26-ому (2) пасажах

Підсумовуючи результати проведених досліджень, слід відзначити, що прослідковується взаємозв' язок між проліферацією калюсів G. acaulis та G. lutea, синтезом у них БАР та умовами культивування in vitro. При введенні в культуру in vitro важливим завданням є підбір таких умов, які б одночасно забезпечували і ріст калюсу, і синтез в ньому цінних вторинних метаболітів. Перешкодою на шляху максимальної реалізації біосинтетичного потенціалу культури тканин часто є антагонізм між процесами проліферації і накопичення БАР. Підібране нами живильне середовище сприяє проходженню обох цих процесів, однак приріст біомаси (максимум на 15-ту - G. acaulis та 20-ту добу - G. lutea) та синтез флавоноїдів і ксантонів (максимум на 40-ву - G. acaulis та 35-ту добу - G. lutea) у калюсних тканинах G. acaulis та G. lutea чітко розмежовані в часі. Виходом з такої ситуації є відбір матеріалу для подальшого пасажування на 21-26-ту доби, тоді як для отримання БАР («знімання врожаю») тривалість пасажу потрібно продовжувати до 35-40-ої доби.

У літературі відсутні дані, що стосуються синтезу флавоноїдів і ксантонів у культурі тканин видів роду Gentiana, проте відомо, що у деяких випадках культура in vitro тирличів втрачає здатність синтезувати інші вторинні метаболіти. Наприклад, проведено порівняльний аналіз вмісту секоіридоїдів у листках інтактних рослин та калюсі G. cruciata. Показано, що в листках рослин амарогентин присутній у достатній кількості, тоді як у калюсі виявлено його залишкові кількості. Проте, в калюсі G. cruciata синтезувалися деякі секоіридоїди, не характерні для інтактних рослин [15].

Висновки

Досліджено динаміку приросту біомаси калюсів кореневого походження G. acaulis (туркульська популяція) і G. lutea (трояська популяція) та синтезу в них ксантонів і флавоноїдів протягом пасажу. Показано зворотну залежність між приростом біомаси і накопиченням БАР. Виявлено, що вміст ксантонів і флавоноїдів протягом пасажу змінювався - був максимальним на 40-ву (G. acaulis) та 35-ту (G. lutea) доби культивування, і перевищував, у випадку калюсу

G. acaulis, аналогічні показники у коренях та пагонах дикорослих рослин туркульської та реберської популяцій, та, у випадку калюсу G. lutea - у коренях рослин цього виду з трояської, рогнєської та пожижевської популяцій. Встановлено, що в процесі тривалого культивування продуктивність калюсних культур залишається відносно стабільною.

1. Біологічно активні речовини видів роду Gentiana L. Вміст ксантонів у культурі тканин // Н.М. Дробик, О.М. Леськова, В.М. Мельник [та ін.] // «Наукові записки» Тернопільського національного педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка. Серія: Біологія. - 2010. - №4 (45). - С. 34-40.

2. Биология клеток растений in vitro и биотехнология: материалы ІХ междунар. конф., 8-12 сентября 2008 г., Звенигород. - Москва, ИД ФБК-ПРЕСС. - 2008. - 462 с.

3. Введення в культуру in vitro деяких видів роду Gentiana L. / Н.М. Страшнюк, Л.Р. Грицак, О.М. Леськова [та ін.] // Физиология и биохимия культ. растений. - 2004. - Т.36, №4. - C. 327-334.

4. Введення в культуру in vitro рідкісного виду Українських Карпат Gentiana verna L. / Н.М. Страшнюк, Н.Б. Кравець, І.І. Конвалюк [та ін.] // Науковий вісник Ужгородського університету. Серія Біологія.

- 2008. - Вип. 22. - C. 49-53.

5. Денисова-Дятлова О.А. Природные ксантоны / Ольга Александровна Денисова-Дятлова, Владимир Иванович Глызин // Успехи химии. - 1982. - Вып. 10. - С. 1753-1773.

6. Кунах В.А. Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні основи / Віктор Анатолійович Кунах. - К.: Логос, 2005. - 730 с.

7. Кунах В.А.    Изменчивость    растительного    генома    в    процессе    дедифференцировки и

каллусообразования in vitro / В.А. Кунах // Физиол. раст. - 1999. - Т.46, №6. - C. 919-929.

8. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учебное пособие для биологических специальностей вузов / Георгий Филиппович Лакин. - М.: Высш. школа, 1980. - 293 с.

9. НосовА.М. Культура клеток высших растений - уникальная система, модель, инструмент /

А.М. Носов // Физиол. раст. - 1999. - Т. 46, №6. - C. 837-844.

10. Носов А.М. Функции вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro / А.М. Носов // Физиол. раст.

- 1994. - Т.41, №6. - С. 873-878.

11. Отримання та біохімічний аналіз культури тканин тирличу безстеблового (Gentiana acaulis L.) / Н.М. Страшнюк, О.М. Леськова, В.М. Мельник, [та ін.] // Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів.

- 2006. - Т.4, №1. - C. 89-95.

12. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция / Владимир Анатольевич Сидоров. -К.: Наук. думка, 1990. - 280 с.

13. Спектрофотометричне визначення суми флавоноїдів у рослинах деяких видів роду Gentiana L. / О.М. Леськова, В.М. Мельник, Г.Я. Загричук [та ін.] // «Наукові записки» Тернопільського національного педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка. Серія: Біологія. - 2004. -№3-4 (24). - С. 54-57.

14. Страшнюк Н.М. Введення в культуру in vitro видів тирличу хрещатого (Gentiana cruciata L.) та тирличу звичайного (Gentiana pneumonanthe L.) / Н.М. Страшнюк, М.О. Твардовська, В.М. Мельник // «Наукові записки» Тернопільського національного педагогічного університету ім. Володимира

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

Н М Дробик - Динаміка ростових та біосинтетичних характеристик культури тканин gentiana acaulis l