Л Івашків, М Целевич, Д Санагурський - Дисперсійний аналіз впливу фторхінолонів на активність na+ к+-атф-ази зародків в'юна - страница 1

Страницы:
1  2 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ

Серія біологічна. 2005. Вип. 40. С. 3-9

VISNYK OF L'VIV UNIV. Biology series. 2005. Is. 40. P. 3-9

Біофізика

УДК: 577.352+577.181.5

ДИСПЕРСІЙНИЙ АНАЛІЗ ВПЛИВУ ФТОРХІНОЛОНІВ НА АКТИВНІСТЬ Na+, К+-АТФ-АЗИ ЗАРОДКІВ В'ЮНА

Л. Івашків, М. Целевич, Д. Санагурський

Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського 4, 79005, м. Львів, Україна e-mail: ivalar_yaro@mail.ru, biofiz@franko.lviv.ua

Оцінено вплив флюміквілу, бороцину та норфлоксацину в концентра-

v_y u,iiiv^iiv7 uxi.jxjri.jj vjjjxxv/ivxxxvijxjxj ^ i_/v/xxxxxxj   їй xxv/j_/vjjjxv/xv^<c»xxxxxxj   jj        і і u,v^ її і j^/ii

ціях 5; 10; 15; 20; 25 мкг/мл (чинник дози) на активність Na+, К+-АТФ-ази в ранній період розвитку (60-330 хв) зародків в'юна (чинник часу) з викорис­танням одно- та двофакторного дисперсійного аналізу. Визначено, що зміни активності ферменту, головно, зумовлені дією досліджуваних фторхіноло-нів і практично не залежать від часу розвитку зародків. Виявлено значну концентраційну залежність активності Na+, К -АТФ-ази від дії кожного з фторхінолонів. Частки впливу зміни їхньої концентрації за весь досліджува­ний період розвитку незначно відрізняються для всіх фторхінолонів і стано­влять 91,1-96,9% <0,01). Відмінності між концентраційними залежностя­ми для досліджуваних антибіотиків протягом початкового періоду розвитку несуттєві.

Ключові слова: зародки в'юна, активність Na+, К+-АТФ-ази, вплив фторхі-нолонів, дисперсійний аналіз.

Фторхінолони - високоефективні хіміотерапевтичні препарати, які широко вико­ристовують як у медицині [8], так і у ветеринарії [17, 19]. У літературі значну увагу при­ділено оцінці токсичності антибіотиків фторхінолонового ряду [7, 8, 12, 17], механізми розвитку якої ще остаточно не з'ясовані. Зокрема, в огляді Є. Падєйської [7] описано хон-дротоксичний ефект дії фторхінолонів на нестатевозрілих тварин. Для риб зафіксовано розвиток токсичності в разі використання флюміквілу внаслідок його акумулювання в організмі [15]. Суттєва роль у розвитку токсичного процесу пов'язана із мембранними сис­темами активного транспортування, зокрема, із Na+, К+-АТФ-азою мембран, від роботи якої значно залежить функційний стан цілісного організму. Цей інтегральний мембранний білок підтримує електрохімічні градієнти Na+ і К+ через плазматичну мембрану, забезпечу­ючи цим захист клітин від осмотичного набухання і перебіг важливих процесів життєдіяль­ності [2]. Відомо, що збільшення Na+, К+-АТФ-азної активності гомогенатів зародків в' юна (Misgurnus fossilis L.) протягом стадії дроблення [1] відіграє важливу роль у зародкових процесах, таких як генерація мембранного потенціалу [3] та формування бластоцелю [14].

Відомо, що ембріони в період розвитку високочутливі до хімічних, фармакологіч­них та інших біологічно активних чинників, тому зародки риб є адекватною тест-системою вивчення токсичного впливу на живі об'єкти [13]. У попередньому досліджен­ні на зародках в' юна ми виявили, що антибіотики фторхінолонового ряду дозозалежно інгібують активність Na+, К+-АТФ-ази мембран [10, 11]. Крім того, у зазначених дослі­дженнях з' ясовано, що чутливість активності Na+, К+-АТФ-ази до дії антибіотиків фтор-хінолонового ряду змінюється на різних стадіях у ранньому ембріогенезі в'юна [10, 11].

Для визначення причини, від якої більше залежать зміни активності Na+, К+-АТФ-ази - від дії фторхінолонів у певних концентраціях чи від часу розвитку зародків, - ми

© Івашків Л., Целевич М., Санагурський Д., 2005вважали за доцільне кількісно оцінити, порівняти та підтвердити впливи цих чинників. Зазвичай, доводиться мати справу з впливом багатьох чинників (як зазначених вище, так і не врахованих в експериментах). Одним із адекватних засобів оцінки впливу кожного з чинників (за відносними частками цих впливів на мінливість значень досліджуваного показника) та їхньої взаємодії, а також підтвердження цих впливів є багатофакторний дисперсійний аналіз [5]. Цей потужний статистичний метод дає змогу виконати адекват­ну експертизу мінливого експериментального матеріалу.

Мета дослідження - кількісно оцінити вплив чинника часу (тривалості розвитку) та фторхінолонів (у різних концентраціях) на зміни активності N+, К+-АТФ-ази зародків в' юна в період раннього ембріогенезу, тобто проаналізувати часову динаміку та концент­раційну залежність цих змін.

Вихідним матеріалом дослідження були експериментальні дані М. Целевич зі спі-вавт. [10, 11], а саме - середні значення активності N+, К+-АТФ-ази плазматичної мем­брани за дії фторхінолонів (флюміквілу, бороцину та норфлоксацину) на послідовних стадіях розвитку зародків в' юна: двох (60 хв), 16 (150 хв), 64 (210 хв) бластомерів та во­сьмого (270 хв) і десятого (330 хв) поділів.

Автори [10, 11] Na+, К+-АТФ-азну активність визначали в гомогенаті зародків в'юна у контрольних умовах та за наявності в середовищі інкубації зазначених вище антибіотиків за такою методикою. Зародки на різних стадіях розвитку гомогенізували за допомогою го­могенізатора Поттера-Ельвенгейма у розчині Гольтфретера. Гомогенат центрифугували 15 хв при 3 000 g. Супернатант розводили дистилятом так, щоб в 0,1 мл проби вміст білка, визначений методом Лоурі [18], не перевищував 100-250 мкг. Для визначення Na+, К+-АТФ-азної активності проводили інкубацію в 1 мл певного середовища (15 хв при 21°С). Для визначення сумарної АТФ-азної активності використовували стандартне середовище інкубації такого складу, мМ: АТФ-№2 - 3,0; MgCl2 - 3,0; NaCl - 100,0; КС1 - 30,0; ЕГТА -1,0; буфер трис-НС1 - 30,0 (рН 7,4; 21°С). У розчин, у якому визначали активність АТФ-ази, додавали фторхінолони до кінцевої концентрації 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0 мкг/мл. Вміст неорганічного фосфату Рн визначали за методом Фіске-Суббароу [6], Na+, К+-АТФ-азну активність - як різницю її активності без та за наявності в середовищі оуабаїну (1 мМ). Ак­тивність ферменту виражали у мікромолях Рн на міліграм білка за годину [10, 11].

Експериментальний матеріал опрацьовували методами одно- та двофакторного дисперсійного аналізу. Для кожного з фторхінолонів - флюміквілу, бороцину та норфло-ксацину - визначали відносні частки впливу фторхінолонів у певних концентраціях (5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0 мкг/мл) та чинника часу розвитку зародків (60, 150, 210, 270 і 330 хв) на зміни активності N+, К+-АТФ-ази на фоні впливу неврахованих у експерименті чин­ників, а також оцінювали статистичну значимість цих впливів. (Для всіх серій аналізу Nt - кількість градацій за чинником часу; Nc - кількість градацій за іншим досліджуваним чинником).

Організація досліджень була такою:

1) двофакторний дисперсійний аналіз для оцінки впливу кожного з фторхінолонів (перший досліджуваний чинник) у певній концентрації на зміни активності N+, К+-АТФ-ази в усі зазначені вище моменти часу розвитку зародків в' юна (другий досліджува­ний чинник). (Зміни активності ферменту в контролі протягом досліджуваного періоду розвитку зіставляли зі змінами за дії фторхінолону в певній концентрації за цей самий період). Виконано по п' ять серій двофакторного дисперсійного аналізу (п' ять різних кон­центрацій) для кожного з фторхінолонів; N=2 (без та за наявності фторхінолону), N=5 (п' ять моментів часу);

2) однофакторний дисперсійний аналіз впливу на активність ферменту зміни (зростання) концентрації кожного фторхінолону (досліджуваний чинник) у фіксовані моменти розвитку зародків в'юна. Виконано по п'ять серій дисперсійного аналізу для кожного фторхінолону за даними, отриманими в певний момент розвитку (60, 150, 210, 270 та 330 хв); Nc=5 (п'ять концентрацій);

3) двофакторний дисперсійний аналіз впливу на активність №+, К+-АТФ-ази зміни (зростання) концентрації кожного з фторхінолонів (перший чинник) і тривалості розвит­ку зародків (чинник часу). Виконано по дві серії аналізу для кожного фторхінолону - як з урахуванням (77=5, Nc=6), так і без урахування контролю (77=5, Nc=5).

Дисперсійний аналіз виконували засобами EXCEL, завдяки яким також оцінювали вірогідність отриманих результатів дослідження. (Критичні рівні значимості під час перевір­ки статистичних гіпотез у цьому дослідженні приймали такими, що дорівнюють 0,05 та 0,01).

На рис. 1 показано статистично значимі (p<0,05) відносні частки впливу досліджу­ваних фторхінолонів (результати 15 серій двофакторного дисперсійного аналізу) на зміни активності (мінливість значень показника) ферменту. Ці частки в разі дії кожного з фтор­хінолонів у всіх досліджуваних концентраціях є близькими за значеннями та дуже висо­кими (91,8-98,3%, p = 0,01), крім норфлоксацину в концентраціях 5 і 10 мкг/мл. За дії останнього антибіотика в концентрації 5,0 мкг/мл майже 50% змін активності зумовлено його впливом, а ще 50% - іншими чинниками. Частки впливу чинника часу не відображе­но, оскільки за дії флюміквілу та бороцину в концентраціях 15-25 мкг/мл вони є незнач­ними (1,2-3,7%, p < 0,05), а також у всіх інших серіях аналізу статистична значимість цього впливу не доведена.

Подібні за значенням частки впливу фторхінолонів не відображають ступеня інгі­бування активності, оскільки частка впливу, як уже зазначено, виявляє лише внесок у зміни активності того чи іншого чинника на фоні впливу інших, неврахованих у експери­менті чинників.

Концентрація, мкг/мл

Рис. 1. Оцінки впливу фторхінолонів у різних концентраціях на активність Ыа+, К+-АТР-ази в зародків в'юна; *p<0,05, вірогідність інших значень - p<0,01 (вплив чинника часу розвит­ку та інших чинників несуттєвий).

Дисперсійний аналіз, як відомо, дає змогу не лише оцінити вірогідність впливу різних чинників на досліджуваний показник та їхній внесок у загальну мінливість показ­ника (у межах 100%), а за значенням відносних (відсоткових) часток впливу чинників порівнювати ці впливи.

Результати цього двофакторного дисперсійного аналізу (див. рис. 1) підтверджу­ють попередньо отримані експериментальні дані про значну залежність активності Na+, К+-АТФ-ази від наявності в середовищі флюміквілу, бороцину та норфлоксацину в пев­ній концентрації протягом раннього розвитку зародків в'юна [10, 11]. Водночас на під­ставі результатів дисперсійного аналізу з'ясовано, що дія досліджуваних препаратів на активність Na+, К+-АТФ-ази на різних стадіях розвитку зародків (різниці якої було виявле­но в попередньо отриманих експериментальних даних [10, 11]) суттєво не відрізняється.

Отже, ми можемо стверджувати, що зміни активності досліджуваної АТФ-ази пе­реважно зумовлені впливом фторхінолонів у різних концентраціях.

Концентраційну залежність активності від дії флюміквілу, бороцину та норфлокса­цину (5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0 мкг/мл) досліджували з використанням одно- та двофакто­рного дисперсійного аналізу. У першому випадку аналіз виконували за даними змін у фіксовані моменти розвитку зародків протягом досліджуваного періоду, а в другому - за весь досліджуваний період (60-30 хв).

Результати 15 серій однофакторного дисперсійного аналізу показано на рис. 2. Про суттєву концентраційну залежність активності у період 60-330 хв розвитку свідчать частки впливу зміни концентрацій як норфлоксацину, так і бороцину. Вони є в діапазоні 73,7-93,0 та 68,1-87,1% для цих антибіотиків, відповідно. Для флюміквілу частка впливу зміни його концентрації висока (81,2%) на 60-й хвилині розвитку та менша (у межах 56,0-59,9%) в інші досліджувані моменти (див. рис. 2). Це доводить, що різні концентрації флюміквілу в період 150-330 хв розвитку зародків ведуть до дещо менших різниць у змінах активності ферменту, ніж різні концентрації норфлоксацину та бороцину. Тобто концентраційна зале­жність активності за дії флюміквілу є меншою, ніж за інших препаратів.

М. Целевич зі співавт. [11] виявили, що зниження активності Na+, К+-АТФ-ази зародків в' юна навіть за дії флюміквілу в концентрації 5 мкг/мл було суттєвішим, ніж за

Рис. 2. Оцінки впливу зміни концентрацій фторхінолонів на активність N+, К+ -АТР-ази для різних стадій розвитку зародків в'юна,p < 0,01.

270

/ Норфлоксацин Бороцин

Флюміквіл

330

Час, хвдії норфлоксацину і бороцину в цій концентрації. Проте зі збільшенням концентрації флюміквілу від 15 до 25 мкг/мл, зокрема протягом 180-330-ї хв розвитку, значення Na+, К+-АТФ-азної активності перекривались та були в діапазоні 4,3-6,3 мкмоль/мг білка за 1 год. Це узгоджується з результатами зазначеного вище дисперсійного аналізу.

Різниці ефектів впливу на активність між досліджуваними антибіотиками (у зазна­чених вище результатах одно- та двофакторного дисперсійного аналізу) можна пояснити відмінністю їхніх фізико-хімічних властивостей. Як зазначено в [12], для норфлоксацину є певні відмінності фармакокінетичних показників порівняно з іншими представниками класу фторхінолонів. Цей препарат має найнижчий показник відносної біодоступності (30—40%), на відміну від інших фторхінолонів, для більшості яких цей показник досягає 80-100%. Крім того, всі фторхінолони мають такі фізико-хімічні властивості, як висока ліпофільність, велике значення pKa та низький ступінь зв'язування з білками [12].

Оскільки в кожному випадку однофакторного дисперсійного аналізу ми не вво­дили чинника часу (аналіз виконували за даними середніх значень активності на кожній стадії розвитку) та не брали до уваги контрольні експериментальні дані, то значимість деяких відмінностей в оцінках, отриманих на різних стадіях розвитку (див. рис. 2), пере­вірили із застосуванням інформативнішого двофакторного дисперсійного аналізу.

Зведені результати аналізу впливу досліджуваних антибіотиків (без та з ураху­ванням контролю) показано на рис. 3. Виявлено значну концентраційну залежність ак­тивності N+, К+-АТФ-ази за дії всіх досліджуваних фторхінолонів. Треба зазначити про деяке збільшення внеску досліджуваного чинника (дії антибіотиків у певній конце­нтрації) в зміни активності ферменту в разі врахування контролю. У цьому випадку для всіх фторхінолонів частки впливу зміни їхньої концентрації є дуже високими (91,1­96,9%).

100,0

83,4

 

80,0 -

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

60,0 -

 

 

-

 

 

 

 

40,0 -

 

 

 

 

 

 

 

20,0 -

 

 

-

 

 

 

і-1

0,0 -

---1

 

 

Ф л

-96^

1,91,4

90,1

95,8

1,8

ЕЁ

3,0

1.3

Вор Бор

91Д

84,7

7,97,5

ШЗ

ІЗ

Нор Нор

■ 1 Ш 2 □ З

Рис. 3. Оцінки впливу зміни концентрації фторхінолонів та чинника часу на зміни активності N+, К+-АТР-ази мембран: стовпчики ліворуч - без урахування контролю, праворуч - з ураху­ванням контролю, p<0,01 (узагальнені результати для всього досліджуваного періоду роз­витку зародків в'юна): 1 - антибіотики: Фл - флюміквіл, Бор - бороцин, Нор - норфлокса-цин; 2 - час; 3 - інші.

Достовірний внесок чинника часу виявлено в разі дії всіх досліджуваних антибіо­тиків, частки яких є незначними, зокрема, з урахуванням контролю вони становлять 1,9-3,0% (див. рис. 3). Тобто виявлені на різних стадіях розвитку (протягом 60-330 хв) відмінності в концентраційній залежності активності Na+, К+-АТФ-ази є несуттєвими.

Відомо, що фторхінолони (за групою -СООН) здатні утворювати хелатні компле­кси з катіонами дво- і тривалентних металів (Mg, Zn, Fe, Ca, Al [7, 8]), зменшуючи їхні концентрації в клітинах. Катіони Са2+ та Mg2+ беруть участь у складних механізмах ре­гулювання функцій Na+, К+-АТФ-ази, тобто є ефективними модуляторами її активності [4]. Зумовлений дією досліджуваних антибіотиків дефіцит катіонів кальцію та магнію, зокрема, внаслідок збільшення концентрації препарату, може бути головною причиною значного інгібування активності Na+, К+-АТФ-ази [10, 11]. У разі дії фторхінолонів та­кож простежується активація вільнорадикальних процесів у тканинах хряща [16], поси­лення перекисного окиснення ліпідів мембран у зародків в' юна [9]. Оскільки функцію-вання Na+, К+-АТФ-ази залежить від стану ліпідного бішару, то зазначені процеси та­кож впливатимуть на її активність. Наведені факти пояснюють причину значного впли­ву фторхінолонів на активність ферменту, який виявлено в цьому дослідженні.

Отже, на підставі виконаного дисперсійного аналізу можна стверджувати з висо­кою достовірністю >0,99), що зміни активності Na+, К+-АТФ-ази переважно зумовле­ні дією досліджуваних фторхінолонів. Підтверджено суттєву концентраційну залеж­ність активності досліджуваного ферменту від дії флюміквілу, бороцину та норфлокса-цину в період дроблення бластомерів в' юна (60-330 хв). Також за допомогою диспер­сійного аналізу з' ясовано, що відмінності дії досліджуваних фторхінолонів та їхні кон­центраційні залежності на різних стадіях розвитку несуттєві, тобто дія антибіотиків майже не залежить від часу розвитку зародків в' юна.

1. Бериташвили Д.Р., Кутателадзе Т.В., Маршани Д.О., Кафиани К.В Аденозинтрифо-сфаты в ембриональном развитии вьюна // Онтогенез. 1974. Т. 5. № 4. С. 363-371.

2. Болдырев А.А. Регуляция активности мембранных ферментов // Биология. 1997. № 6. С. 21-27.

3. Гойда Е.А., Медына И.Р., Санагурский Д.И., Стельмах Н.С. Характеристики элект­рофизиологических параметров мембран эмбриональных клеток вьюна при инги-бировании Na+, К+-АТФ-азы // Онтогенез. 1989. Т. 20. № 2. С. 164-170.

4. Кравцов А.В., Кравцова В.В. Регуляция Na+, К+-АТР-азы: эффекты ионов Мg2+ и Ca2+ // Укр. біохім. журн. 2001. Т. 73. № 2. С. 3-27.

5. ЛюбищевАА. Дисперсионный анализ в биологии. М.: Изд-во Москов. ун-та, 1986. 200 с.

6. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). Учеб. пособие / Под ред. М.И. Прохоровой. Л.: Изд-во Ленинград. ун-та, 1982. 272 с.

7. Падейская Е.Н. Артротоксичность хинолонов и фторхинолонов в эксперименте: характер поражений и возможный механизм действия // Антибиотики и химиоте­рапия. 2000. Т. 45. № 8. С. 36-41.

8. Падейская Е.Н., Яковлев В.П. Антимикробные препараты группы фторхинолонов в клинической практике. М.: Лагота, 1998. 351 с.

9. Тарновська А.В., Дика М.В., Санагурський Д.І. Перекисне окислення ліпідів та анти­оксидантний статус у зародків в' юна за умов впливу фторхінолонів // Наук. вісн. Львів. акад. вет. медицини ім. С.З. Гжицького. 2004. Т. 6. № 1. Ч. 2. С. 260-266.

10. Целевич М.В., Бойко Н.М., Мандзинець С.М., Санагурський Д.І. Інгібувальний вплив фторхінолонів на Na+, К+-АТФ-азну активність зародків в'юна Misgurnus fossilis L. // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. 2004. Вип. 35. C. 40-46.

11. Целевич М.В., Санагурський Д.І. Вплив флюміквілу на активність №+, К+-АТФ-ази зародків в'юна // Біологія тварин. 2003. Т. 5. № 1, 2. С. 289-294.

12. Яковлев В.П. Фармакокинетика фторхинолонов // Антибиотики и химиотерапия.

1993. Т. 38. № 6. С. 66-78.

13. Nagel R., Dar T. The embryo test with the Zebrafish Danio rerio a general model in ecotoxicology and toxycology // ALTEX. 2002. Vol. 19. N 1. P. 38-48.

14. Burgener-Kairuz P., Corthesy-Theulaz I., Merillat A.M. et al. Polyadenilation of Na+fl<.+-ATPase beta 1-subunit during early development of Xenopus laevis // Am. J. Physiol.

1994. Vol. 266. N 1. P. 157-164.

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

Л Івашків, М Целевич, Д Санагурський - Дисперсійний аналіз впливу фторхінолонів на активність na+ к+-атф-ази зародків в'юна