Ю Стецишин - Дослідження адсорбції альбуміну на поверхні модифікованого скла методом еліпсометрії - страница 1

Страницы:
1  2 

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF LVIV UNIV.

Серія біологічна. 2010. Вип. 54. С. 51-58 Biology series. 2010. Is. 54. P. 51-58

Біотехнологія

УДК 676:66.08/09; 541.64; 544.773.432

ДОСЛІДЖЕННЯ АДСОРБЦІЇ АЛЬБУМІНУ НА ПОВЕРХНІ МОДИФІКОВАНОГО СКЛА МЕТОДОМ ЕЛІПСОМЕТРІЇ

Ю. Стецишин*, А. Коструба**, О. Жолобко*, Т. Курисько*, В. Дончак*, Х. Гаргай*, Л. Ріпак*, С. Воронов*

Національний університет «Львівська Політехніка» вул. С.Бандери, 12, Львів 79013, Україна Інститут фізичної оптики, вул. Драгоманова, 23, Львів 79005, Львівська комерційна академія, вул. Самчука, 9, Львів 79011, Україна e-mail: yrstecushun@ukr.net

Створення стійких наношарів білків на поверхнях матеріалів має велике значення при розробці імплантатів і біосенсорних систем. Основ­ний метод створення наношарів білків - це їхня специфічна та неспецифіч­на адсорбція на поверхні. У роботі, за допомогою методу еліпсометрії до­сліджували адсорбцію на поверхні модифікованого скла бичачого сироват­кового альбуміну (BSA). Показано закономірності адсорбції альбуміну на поверхні різної хімічної природи при різних рН. Розраховано товщини адсорбованих наношарів, об'ємну фракцію альбуміну в адсорбованих наношарах і питому кількість адсорбованого альбуміну. Особливо слід відзначити утворення щільно упакованих наношарів альбуміну на поверх­нях, модифікованих декстраном, при відносно низькій його адсорбції.

Ключові слова: модифікація поверхонь, декстран, адсорбція білків, альбу­міни, BSA, еліпсометрія.

Розуміння механізмів взаємодії білків з поверхнями є фундаментальним напря­мом досліджень у біології, біотехнології, фармакології та медицині. Одним із ключових моментів у цих дослідженнях є вивчення закономірностей процесу адсорбції білків, у результаті якого поверхня може набувати таких біоспецифічних властивостей, як біосу-місність, зокрема гемосумісність тощо [2, 25]. Важливим напрямом хімії біосумісних матеріалів є створення поверхонь, які запобігають адсорбції білків - «non fouling» пове­рхонь або легко адсорбують біологічно пасивні білки, наприклад альбумін [15]. Крім того, при створенні біосенсорних систем важливе значення має не тільки природа білка-біосенсора та спосіб його зв' язку з поверхнею, але і конформація адсорбованого білка на поверхні [12].

Дослідження адсорбції білків поділяють на два напрями. Перший - це скринінг модифікованих поверхонь на їхню резистентність до адсорбції або на здатність до контро­льованої адсорбції певних білків [9, 17]. Другий напрям досліджень - вивчення кінетич­них закономірностей процесів специфічної та неспецифічної адсорбції білків [7, 11, 13].

Бичачий сироватковий альбумін (BSA) є найцікавішим білком для створення біо-сумісних поверхонь і біосенсорних систем [5, 6, 26]. Дослідженню закономірностей його адсорбції на поверхні різного типу присвячено низку публікацій [14, 21, 22]. Проте слід відзначити, що у цих публікаціях вивченню структури утвореного наношару аль­буміну приділяється незначна увага. Крім того, недостатньо висвітлено питання ад­сорбції альбуміну на поверхні, які модифіковані полісахаридом декстраном, хоча є

© Стецишин Ю., Коструба А., Жолобко О. та ін., 2010публікації, в яких показано здатність утворювати стійкі комплекси між макромолекула­ми декстрану й альбуміну в розчині [20]. Тому особливо перспективною, на наш по­гляд, є адсорбція альбуміну на поверхні, що попередньо модифіковані прищепленим шаром декстрану. У попередніх роботах [23] ми показали можливість модифікації по­верхонь полімерів макромолекулами декстрану, а також значну адсорбційну активність альбуміну щодо модифікованих поверхонь [24].

Дана робота присвячена вивченню адсорбції макромолекул альбуміну на поверх­ню силікатного скла, яка попередньо модифікована прищепленим шаром декстрану. Для створення такої поверхні скляні пластинки обробляли у-амінопропіл(триетокси) силаном, у результаті чого на них іммобілізувалися первинні аміногрупи. За участю цих аміногруп до поверхні модифікованого скла прищеплювали діальдегіддекстран [1], який одержували частковим окисненням декстрану перйодатною кислотою (рис. 1) [16].

C2H5O

rf^O—Si,

C2H5O

NH2    h2n H2N

2 \ 2

- m C2H5OH

OH    OH OH OH

1 111

Si Si     Si Si

OH oh

Si Si

OH

O O     O O

Si

oh O/i~--o^r

O о о

Поверхня скла

h2n H2N

о      о   оHO

I-\-1-h-*—I-i

si      Si   Si     Si      Si   Si Si

Поверхня амінованого скла

+Розчин окисненого декстрану

Х-о."

Si Si     Si        Si Si    Si Si

Поверхня амінованооо скла, модифікована декртромом

Рис. 1. Схема модифікації поверхні скла.

Важливим сучасним методом дослідження товщини та структури поверхневих наношарів є метод еліпсометрії [3, 4], який відзначається високою точністю й достовір­ністю одержаних результатів. У деяких роботах показана можливість застосування цьо­го методу для дослідження адсорбції білків і встановлення структури отриманих білко­вих наношарів [14, 22]. Ми застосували еліпсометричний метод для дослідження залеж­ності товщини й оптичних параметрів адсорбованих наношарів альбуміну від часу ад­сорбції. У роботі використані цитратно-фосфатні (буферні) розчини альбуміну зі зна­ченнями рН 3 та 7,4 і концентрацією альбуміну у розчині 0,2 мг/мл. Ізоелектрична точка (рІ) сироваткових альбумінів лежить у межах значень рН 4,3-4,8.

На рис. 2 наведені криві залежності висоти наношару альбуміну (а) та індексу рефракції поверхні (б) від часу адсорбції альбуміну з цитратно-фосфатного розчину при

метанолрН=7,4 на поверхні «чистого» та модифікованого скла. Видно, що після значної почат­кової адсорбції альбуміну на поверхні скла відбувається його часткова десорбція і вста­новлюється динамічна рівновага, яка веде до формування на поверхні термодинамічно стійкого наношару. Ці закономірності зберігаються як для немодифікованої, так і для амінованої скляних поверхонь.

Поряд із тим, на поверхні, модифікованій декстраном (кружки), висота наношару альбуміну після досягнення певного значення практично не змінюється. Одночасно у процесі адсорбції зростає показник індексу рефракції, що свідчить про утворення ущі­льненого наношару альбуміну на поверхні, модифікованій декстраном.

X

's

>.

ID

ч й

й

а

й s-о о К

т

3a

Час адсорбції, год

ер -в­ер о

л

2 4

Час адсорбції, год

Рис. 2. Залежність висоти наношару альбуміну (а) та індексу рефракції отриманої плівки (б) від часу адсорбції альбуміну. Концентрація розчину альбуміну становить 0,2 мг/мл, рН=7,4. Поверхня скла - трикутники; поверхня скла, модифікована у-амінопропіл(триетокси) силаном, - квадрати; поверхня скла, модифікована у-амінопропіл(триетокси)силаном і декстраном, - кружки.

Слід відзначити, що макромолекула бичачого сироваткового альбуміну склада­ється з трьох доменів: при рН=7,4 два з них зарядженні негативно, а один нейтрально (рис. 3) [8, 18]. Різні заряди на поверхні альбуміну дозволяють формувати наношари його макромолекул на заряджених поверхнях. При утворенні розчину альбуміну з рН нижче ізоелектричної точки його властивості значно змінюються [19]. Зокрема, змінюється конформація, зростає в'язкість і значно знижується розчинність. Ці зміни можуть сприяти формуванню стійких наношарів альбуміну на поверхнях.

Процес адсорбції альбуміну з кислого буферного розчину (рН=3) відбувається дещо інакше. Так, висота отри­маних наношарів альбуміну на поверхні скла й амінованого скла є значно меншою (рис. 4, а), а значення індексу рефракції -значно вищим (рис. 4, б). Зрос­тання товщини наношару аль­буміну при адсорбції з кислого розчину можна пояснити зміною

його конформації [8,  19], при

г.          . Рис. 3. Схематична репрезентація молекули бичачого сиро-

якій утворюються більш щільно ваткового альбуміну (BSA) при рН=7,4 наведена у

упаковані   наноструктури   аль- роботі [8, 18].

1.55

1.50

1.45

50

1.40

уміну. Поряд із тим, висоти наношарів альбуміну на поверхні, модифікованій декстра-ном, практично не залежать від значення рН альбумінового розчину, а індекс рефракції шару буде трохи більшим, якщо адсорбцію вести з кислого розчину.

X

5?

>. ю

І

а

й о К

т

4a

0 2 4

Час адсорбції, год

Й

•6*

(d ер

ч їв

1.50-

2 4 6

Час адсорбції, год

Рис. 4. Залежність висоти наношару альбуміну (а) та індексу рефракції отриманої плівки (б) від часу адсорбції альбуміну. Концентрація розчину альбуміну становить 0,2 мг/мл, рН=3. Поверхня скла - трикутники; поверхня скла, модифікована у-амінопропіл(триетокси) силаном, - квадрати; поверхня скла, модифікована у-амінопропіл(триетокси)силаном і декстраном, - кружки.

Особливості структури наношару альбуміну можна оцінити за індексом рефрак­ції. Значення індексу рефракції поверхневої плівки несе інформацію про об'ємну фрак­цію альбуміну (щільність пакування плівки) в адсорбованому шарі. У гетерогенній сис­темі об' ємну фракцію полімеру (альбуміну) можна розрахувати за рівнянням Максвелла-Гарнета [3, 4]:

V

pol

n2 + 2nl

n

pol

n

npoi + 2<

(1)

де Vpol - об'єм плівки полімеру, Vf- об'єм гетерогенної поверхневої плівки, ne -індекс рефракції поверхні, отриманий еліпсометричним методом, npol - індекс рефракції поверхні «чистого» альбуміну, nm - індекс рефракції оточуючого середовища (розчинник або повітря), котрі формують гетерогенну структуру в полімерному нано-шарі. Індекс рефракції поверхні «чистого» матеріалу отримували шляхом інтерпретації лінійної залежності індексу рефракції розчину альбуміну (ns) від його концентрації у розчині (с). Вимірювання проводили в ділянці концентрацій 0,1-2,5%, потім застосува­ли лінійну апроксимацію як функцію:

n

f (с) = a + b с

(2)

де a, b - константи. Ці константи були використанні для визначення індексу рефракції альбуміну за умови с=100%. Знайдене значення індексу рефракції для «чистого» альбу­міну становить 1,54.

1.55

50

1.45

Залежність вмісту об' ємної фракції альбуміну від часу адсорбції для різних умов наведено на рис. 5. Щільність пакування альбуміну для всіх трьох видів поверхонь є вищою при адсорбції з кислого буферного розчину (рН=3).

к л

0 2 4 6

Час адсорбції, год

Рис. 5. Залежність об'ємної фракції (щільність пакування) альбуміну від часу адсорбції. Поверхня скла - трикутники; поверхня скла, модифікована у-амінопропіл(триетокси)силаном, - ква­драти; поверхня скла, модифікована у-амінопропіл(триетокси)силаном і декстраном, -кружки. Пунктирною лінією позначені криві адсорбції з розчину альбуміну при рН=3, суцільною при рН=7,4.

Значення абсолютних величин адсорбції альбуміну (мг/м2) розраховували на ос­нові даних експериментальних еліпсометричних досліджень згідно з рівнянням (3).

pol

V7

(3)

де /5=1,281 - густина альбуміну [10], df - товщина полімерного наношару.

На рис. 6 показана залежність кількості адсорбованого альбуміну (мг/м2) від три­валості процесу адсорбції. На поверхню як звичайного, так і амінованого скла більше альбуміну сорбується з нейтрального розчину (рН=7,4), ніж із кислого (рН=3). У випад­ку поверхні, модифікованої декстраном, кількість адсорбованого альбуміну практично не залежить від рН розчину.

>> ю

« я я

й

03

о ю ср о

300

200

100'

0 2 4

Час адсорбції, год

A

d

0

Рис. 6. Залежність кількості адсорбованого альбуміну (мг/м2) від часу адсорбції. Поверхня скла -трикутники; поверхня скла, модифікована у-амінопропіл(триетокси)силаном, - квадрати; поверхня скла, модифікована у-амінопропіл(триетокси)силаном-декстраном, - кружки. Пунктирною лінією позначені криві адсорбції з розчину альбуміну при рН=3, суцільною при рН=7,4.

У результаті дослідження процесу адсорбції бичачого сироваткового альбуміну на поверхні скла та модифікованого скла можна зробити висновок, що найбільш термо­динамічно стійкі, щільно упаковані наношари альбуміну утворюються на поверхнях, модифікованих декстраном, що пов' язане з утворенням альбумін-декстранових компле­ксів. Крім того, структура утворених наношарів при адсорбції альбуміну з розчинів, як при рН=3, так і при рН=7,4, на поверхні, модифіковані декстраном, є подібною. Поверх­ні, модифіковані декстраном, на які адсорбований альбумін, мають перспективи для використання їх як імплантатів і біосенсорних систем.

Робота фінансово підтримувалася державним фондом фундаментальних дослі­джень України (ДФФД), грант Президента України для підтримки наукових дослі­джень молодих учених GP/F27/0070.

1. Кочетков Н., Бочков А., Дмитриев Б. и др. Химия углеводов. М.: Химия, 1967. 672 с.

2. Andrade J. D., Hlady V. Protein adsorption and material biocompatibility: A tutorial re­view and suggested hypothesis // J. Polym. Sci. 1986. Vol. 79. Р. 1-63.

3. AzzamR. M. A., BasharaN. M. Ellipsometry and polarized light // Mir. Moscow. 1981. 330 p.

4. Bootsma G. A., Meyer F. Ellipsometry in the sub-monolayer region // Surface Science. 1969. Vol. 14. Р. 52.

5. Brynda E., Houska M., Jirouskova M., Dyr J. E. Albumin and heparin multilayer coatings for blood-contacting medical devices // J. Biomed. Mater. Res. 2000. Vol. 51. Р. 249-257.

6. Brynda E., Houska M. Ordered multilayer assemblies: Albumin/heparin for biocompati­ble coatings and monoclonal antibodies for optical immunosensors // In: Lvov Y, Mohwald H editors. Protein Architecture: Interfacing Molecular Assemblies and Immo­bilization Technology. New York: Marcel Dekker. 2000. Р. 251-286.

7. Calonder C., Tie Y., van Tassel P. R. History dependence of protein adsorption kinetics // PNSA. 2001. Vol. 98. Р. 10664-10669.

8. Carter D.C., Ho J.X. Structure of serum albumin // Adv. Protein Chem. 1994. Vol. 45. Р. 153-203.

9. Chapman R. G., Ostuni E., Liang M. N. et al. Polymeric thin films that resist the adsorp­tion of proteins and the adhesion of bacteria // Langmuir. 2001. Vol. 17. Р. 1225-1233.

10. Chick and Martin. The density and solution volume of some proteins // Zeitsch. Chem. Ind. Kolloide. 1912. Vol. 11. Р. 102-105.

11. Fang F., Szleifer I. Effect of molecular structure on the adsorption of protein on surfaces with grafted polymers // Langmuir. 2002. Vol. 18. Р. 5497-5510.

12. Gouda M. D., Kumar M. A., Thakur M. S, Karanth N. G. Enhancement of operational stability of an enzyme biosensor for glucose and sucrose using protein based stabilizing agents // Biosens. Bioelectron. 2002. Vol. 17. Р. 503-507.

13. Hibbert D. B., Googing J. J., Erokhin P. Kinetics of irreversible adsorption with diffusion: Application to biomolecule immobilization // Langmuir. 2002. Vol. 18. Р. 1770-1776.

14. Ladam G., Schaaf P., Decher G., Voegel J.-C., Cuisinier F. J. G. Protein adsorption onto auto -assembled polyelectrolyte films // Biomolecular Engineering. 2002. Vol. 19. Р. 273-280.

15. Lassen B., Malmsten M. Structure of protein layers during competitive adsorption // J. Colloid Interface Sci. 1996. Vol. 180. Р. 339-349.

16. Miksa D., Irish E. R., Chen D. et al. Dextran Functionalized Surfaces via Reductive Animation: Morphology, Wetting, and Adhesion // Biomacromolecules. 2006. Vol. 7.

Р. 557-564.

17. Ostuni E., Chapman R. G., Holmlin R. E. et al A survey of structure-property relationships of surfaces that resist the adsorption of protein // Langmuir. 2001. Vol. 17. Р. 5605-5620.

18. Peters T. All About Albumin. Biochemistry, Genetics and Medical Applications // Aca­demic Press. San Diego, USA. 1996. Р. 188-250.

19. Peters T. J. Serum albumin // Adv. Protein Chem. 1985. Vol. 37. Р. 161-245.

20. Ponder E., Ponder R. The Interaction of Dextran with Serum Albumin, Gamma Globulin and Fibrinogen // J. General Physiol. 1960. Vol. 43. Р. 753-758.

21. Rabe M., Verdes D., Seeger S. Surface-induced spreading phenomenon of protein clus­ters // Soft Matter. 2009. Vol. 5. Р.1039-1047.

22. Sapsford K. E., Ligler F. S. Real-time analysis of protein adsorption to a variety of thin films // Biosensors and Bioelectronics. 2004. Vol. 19. Р. 1045-1055.

23. Stetsyshyn Yu., Donchak V., Harhay Kh. et al. Modification of poly(ethylene terephta-late) surface by attached dextran macromolecules // Polym. Int. 2009. Vol. 58. N 9. P. 1034-1040.

24. Voronov S., Tokarev V., Samaryk V. et al. Chemische Modifizierung peroxidierter Po-lymeroberflachen fur die Anwendung in der Medizin // Abstrack Book of International Symposium "Technomer". 2003. P. 118.

25. Walker R. K., Krishnaswamy S. The contribution of the substrate-membrane interaction to catalysis // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. Р. 27441-27450.

26. Yu S. Y., Hu J. H., Pan X. Y. et al. Stable and pH-sensitive nanogels prepared by self-assembly of chitosan and ovalbumin // Langmuir. 2006. Vol. 22. Р. 2754-2759.

RESEARCH OF ALBUMIN ADSORPTION ON THE MODIFIED GLASS SURFACES BY METHOD OF ELLIPSOMETRY

Yu. Stetsyshyn*, A. Kostruba**, O. Zolobko*, Т. Kurysko*, V. Donchak*, H. Harhay*, L. Ripak*, S. Voronov*

National University «Lvivska Politechnika» 12, S. Bandera St., Lviv 79013, Ukraine Lviv Institute for Physical Optics, 23, Dragomanov St., Lviv 79005, Lviv Academy of Commerce, 9, Samtshuk St., Lviv 79011, Ukraine e-mail: yrstecushun@ukr.net

Creation of stable proteins nanolayers on the surfaces of materials has very much sense at development of implants and biosensory systems. Main method creation of protein nanolayers it is them specific and nonspecific ad­sorption on surfaces. In work by the method of ellipsometry, we investigated adsorption of bovine serum albumin (BSA) on the modified glass surfaces. Reg­ularity of the albumin adsorption on surfaces with different chemical nature at different pH is showed. The thickness of adsorbed nanolayers, volume fraction of albumin in adsorbed nanolayers and albumin adsorbed amount is calculated. Especially, it is significant, formation high density packing albumin nanolayers on surface modified by dextran at relatively low amount his adsorption.

Key words: surfaces modification, dextran, protein adsorption, albumin, BSA, ellipsometry.

ИССЛЕДОВАНИЕ АДСОРБЦИИ АЛЬБУМИНА НА ПОВЕРХНОСТИ МОДИФИЦИРОВАННОГО СТЕКЛА МЕТОДОМ ЭЛЛИПСОМЕТРИИ

Ю. Стецишин*, А. Коструба**, О. Жолобко*, Т. Курисько*, В. Дончак*, Х. Гаргай*, Л. Рипак*, С. Воронов*

Национальный университет «Львовская Политехника» ул. С. Бандеры, 12, Львов 7901, Украина Институт физической оптики, ул. Драгоманова, 19, Львов 79011 Львовская коммерческая академия, ул. Самчука, 9, Львов 79011, Украина e-mail: yrstecushun@ukr.net

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

Ю Стецишин - Дослідження адсорбції альбуміну на поверхні модифікованого скла методом еліпсометрії

Ю Стецишин - Модифікація поверхні поліетилентерефталату декстрином

Ю Стецишин - Структура та властивості поверхні пероксидованого скла модифікованого полі