Д Ю Кустов - Дослідження впливу трансплантації ембріональних стовбурових клітин на поведінку щурів після опромінення - страница 1

Страницы:
1  2 

Проблеми екології та охорони природи техногенного регіону. - 2011. - № 1 (11).

УДК 599.323.4 : 614.876-06-089.843 : 576.3

© Д. Ю. Кустов, І. В. Кокіна, М. І. Тарапата ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ ЕМБРІОНАЛЬНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН НА ПОВЕДІНКУ ЩУРІВ ПІСЛЯ ОПРОМІНЕННЯ

Донецький національний медичний університет ім. М. Горького 83003, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16; e-mail: physiolog@mail.ru

Кустов Д. Ю., Кокіна І. В., Тарапата М. І. Дослідження впливу трансплантації ембріональних стовбурових клітин на поведінку щурів після опромінення. - Статтю присвячено дослідженню грумінга і загальної рухової активності у щурів після гострого або хронічного гамма-опромінення та подальшого введення ембріональних стовбурових клітин. Обидва способи опромінення призводили до істотного зниження грумінгової активності, але підвищували загальну рухову активність тварин. Трансплантаційна корекція стану нейроімуноендокринної системи відновлювала початковий рівень досліджуваних показників поведінки у більшості експериментальних особин.

Ключові слова: трансплантація, ембріональні стовбурові клітини, грумінг, опромінення.

Вступ

Проблема корекції радіаційних уражень організму є украй важливою для забрудненого регіону Донбасу і України в цілому. Кількість захворювань, спричинених як прямим опроміненням, так і віддаленими його наслідками в нашій країні складає дуже великий відсоток від викликаних іншими чинниками. Крім того, велику увагу лікарів привертає комплекс дій, спрямованих на реабілітацію після променевої терапії онкологічних хворих.

Променева хвороба являє собою самостійне захворювання, що розвивається в результаті загибелі переважно клітин організму, здатних до ділення під впливом іонізуючої радіації. Причиною променевої хвороби можуть бути як аварія, так і тотальне опромінення організму з лікувальною метою - при трансплантації кісткового мозку, при лікуванні множинних пухлин.

Одним із найбільш суперечливих питань дії малих доз опромінення є питання про вплив зовнішнього та внутрішнього опромінення на ЦНС, яка, за законами класичної радіобіології, була віднесена до резистентних малочутливих до дії опромінення біологічних тканин [1]. У той же час клінічні спостереження за розвитком нейропсихічної патології у ліквідаторів, а також експериментальні дослідження дали привід узяти під сумнів справедливість такого твердження [2-6]. Багаторічні спостереження за виникненням та розвитком патологічних станів у ліквідаторів дозволили виявити дуже важливі клінічні дані, що свідчать про чутливість ЦНС до дії малих доз опромінення. Так, якщо в 1988 р. дисциркуляторну енцефалопатію виявили в 1% ліквідаторів, то в 1992 р. - уже в 71%, а в 1994 р. - у 98% ліквідаторів, тоді як інші захворювання (патологія травного каналу, легень та ін.) виявили не більше ніж у 50% ліквідаторів [7].

Більше того, значна група дослідників, які раніше всі зміни в ЦНС у ліквідаторів визнавали як прояви вегетосудинної дистонії і як наслідок психоемоційного стресу [8-11], в останні роки також стали говорити про можливий розвиток енцефалопатії при дії опромінення [12]. Таким чином, сьогодні можна вважати, що ЦНС є чутливою до дії не тільки середніх та великих, але й малих доз опромінення.

Підсумовуючи численні дослідження про вплив надлетальних, великих (які призводять до променевої хвороби) та малих доз опромінення на ЦНС, потрібно не відмежовувати вплив великих доз від малих, а, навпаки, виявити зміни ЦНС, зіставляючи дію великих та малих доз опромінення, вплив опромінення загального та локального на головний мозок. Таке дослідження дозволить більш повно уявити патогенез радіаційного ураження нервової системи. Доцільно комплексно розглядати всі види радіаційних уражень ЦНС, враховуючи дію зовнішнього загального, локального та внутрішнього опромінення на структуру та функцію ЦНС у цілому або її певних структур, а також молекулярно-генетичних уражень, що в більш віддалений період можуть призвести до розвитку пухлин головного мозку та оболонок або до різних вад розвитку в дітей, котрі були опромінені в період ембріонального розвитку [1].

Сьогодні можна стверджувати, що можливі два види радіаційного впливу на нервову систему. Перший - це пряма дія опромінення, коли на функцію, структуру та метаболізм нервових клітин прямо впливають зовнішнє або внутрішнє опромінення, що доведено можливістю накопичення в мозковій тканині радіонуклідів [13]. Другим, більш вивченим механізмом дії малих доз опромінення на ЦНС є непрямий вплив, який реалізується через порушення функції мозкових судин, метаболічні та інтоксикаційні зміни в організмі, розвиток нейроаутоімунних процесів та інше.

Як засвідчили морфологічні та електронно-мікроскопічні дослідження, радіаційний вплив проявляється як в клітинах глії, так і в нейронах, зумовлює порушення структури гематоенцефалічного бар'єру та різних субклітинних структур, а також біохімічних процесів, що в свою чергу призводить до набухання та набряку нервових клітин, їх зморщення та загибелі [14-16].

Таким чином, загальні ланки патогенезу радіаційного ураження ЦНС в основному вже визначені завдяки клінічним спостереженням за хворими на пострадіаційну енцефалопатію, а також експериментальним дослідженням. Але значення прямої чи непрямої дії опромінення на ЦНС, їх «частка» в патогенезі залежать від конкретних умов розвитку радіаційного ураження ЦНС та вихідного стану здоров'я. Подальші дослідження дозволять конкретизувати значення різних чинників зовнішнього та внутрішнього опромінення (доза, тривалість опромінення, вид радіонукліда та ін.), а також визначити особливості радіаційної патології, перебіг якої може бути пов'язаний переважно з дисциркуляторними, чи інтоксикаційними, чи нейроімунними процесами.

Водночас у клінічній практиці зараз досить широко використовують термін дисциркуляторна енцефалопатія, замість терміну пострадіаційна чи радіаційна енцефалопатія, що не відповідає сучасному уявленню про патогенез радіаційного враження мозку, оскільки все зводиться в основному лише до порушення кровообігу в ЦНС, патології регуляції судин мозку, провідній ролі одного дисциркуляторного чинника без урахування наведених вище рушійних чинників та цілісності патогенезу. Не виключено, що в певної частини хворих дисциркуляторні явища на відповідних стадіях розвитку енцефалопатії можуть бути домінуючими, але в цілому, враховуючи багатогранний механізм дії, складність патогенезу, особливості клінічного перебігу та питання патогенетично зумовленого лікування, доцільно говорити про радіаційну або пострадіаційну енцефалопатію, на що досить обґрунтовано вказують деякі автори [17-19].

З іншого боку, в медичній практиці і в науковій літературі досить багато уваги приділяється питанню про значення психоемоційного стресу в патології ЦНС як основної, більш важливої, ніж вплив опромінення, причини [7, 9]. У клінічній практиці при спостереженні за хворими з радіаційними порушеннями ЦНС досить важко врахувати переважне значення радіаційного чинника чи психоемоційного стресу в генезі порушень, що виникають. Водночас експериментальні дослідження [4, 20] однозначно свідчать, що основним етіологічним чинником є все ж радіаційний вплив, а «радіофобія» є додатковим модифікуючим чинником. Не виключено, що в певної частини хворих, схильних до нервово-психічних порушень, психоемоційний стрес може спричинити теж складні функціонально-органічні порушення в ЦНС, які клінічно подібні до радіаційного ураження нервової системи.

Якщо у вивченні різних ланок патогенезу, визначенні ролі основних та додаткових чинників радіаційного враження ЦНС досягнуто певних успіхів, то у формуванні нових підходів до лікування і профілактики поки що принципово нових розробок немає.

Об'єктивне прогнозування подальшого впливу опромінення на ЦНС можливе лише на основі глибоких клінічних та фундаментальних досліджень, які мають проводити фахівці різних професій.

Останнім часом науковці приділяють проблемі стовбурових клітин значну увагу. У світовій науковій літературі можна зустріти багато протилежних думок щодо етики абобезпеки їх застосування [21-23]. І все ж таки прихильників stem cells-терапії стає дедалі більше.

Виявлення стовбурових клітин-попередників з вираженою здібністю до проліферації та диференціації відкриває можливості їх застосування для лікування дегенеративних, посттравматичних і наслідуваних захворювань [23, 24].

У даний час кріопрезервовані регіональні стовбурові клітини пупкової вени використовуються головним чином при лікуванні лейкемії, пухлин, спадкових метаболічних дефектів і імунодефіцитів, але у найближчий час сфера їх медичного використовування значно розшириться [25, 26].

У зв'язку з вищенаведеним ми вважали доцільним дослідити можливість застосування стовбурових клітин кордової крові в корекції порушень ЦНС, викликаних гамма-опроміненням.

Матеріал і методи дослідження

Експерименти проводили в лабораторії клінічної і прикладної нейрофізіології Донецького національного медичного університету на статевозрілих самцях безпорідних білих щурів, масою від 180 до 300 грамів, розподілених на 5 рівновеликих груп по 10 особин у кожній:

1. Інтактні.

2. Гостре опромінення (контроль).

3. Хронічне опромінення (контроль).

4. Гостре опромінення з введенням ЕСК (дослідна).

5. Хронічне опромінення з введенням ЕСК (дослідна).

Опромінення проводилось на приладі Рокус М № 126 - гама-терапевтичний апарат в радіологічному відділенні Донецького онкологічного центру (м. Донецьк). Гостре опромінення проводилось одноразово. Доза гострого опромінення становила 6,5 Гр. Хронічне опромінення проводилось протягом місяця. Щурі піддослідної групи отримували через добу опромінення в дозі 0,5 Гр. Сумарна доза хронічного (пролонгованого) опромінення становила 6,5 Гр.

Трансплантацію ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) здійснювали внутрішньовенним введенням суспензії, отриманих з кордової крові людини.

Спостереження за реакціями самоочищення проводили у різний час протягом всього світлового дня. Для реєстрації показників грумінгу тварин поміщали до біоритмокамери розробки лабораторії клінічної та прикладної нейрофізіології ДонНМУ сумісно з ТОВ «Медтехприбор». Перші 15 хв. відводились для адаптації до умов камери, після чого протягом подальших 15 хв. проводили візуальне спостереження й підрахунок 4-х різних видів спонтанних рухів очищення шкіри (умивання, лизання, чухання і обтрушування) [27]. Крім того, як додаткові показники ми фіксували загальну кількість рухів самоочищення і загальний час, що витрачає тварина на грумінг за період спостереження, інтенсивність грумінгу та відсоток часу грумінгу [28]. Один рух самоочищення приймався за один елементарний грумінговий акт (е.г.а.). Фіксувалась також загальна рухова активність тварини (тобто переміщення по клітці), яка була виражена у процентному відношенні до загального часу спостереження.

Аналіз результатів спостережень проводили у середовищі пакетів статистичного аналізу MedStat (Альфа, 2004 р.) і Statistica (Statsoft Inc., 1998 р.).

Для обробки даних, отриманих у процесі дослідження, застосовувались методи описової статистики, обчислювалось значення середнього арифметичного (хср) і довірчого інтервалу (ДІ) за а=0,05.

Для порівняння показників різних вибірок застосовувались критерії перевірки статистичних гіпотез. При порівнянні двох вибірок, коли розподіл не відрізнявся від нормального, для порівняння середніх використовувався критерій Стьюдента, якщо ж розподіл ознак відрізнявся від нормального, - критерій Вілкоксона. У разі порівняння 3-х ібільше вибірок між собою аналіз проводився у два етапи. Для виявлення впливу факторної ознаки використовувався критерій Краскела-Уоліса, при проведенні множинних порівнянь -критерій Данна. Вірогідними в усіх випадках вважали відмінності при р<0,05.

Результати та їх обговорення

Нами було досліджено зміни грумінгової та рухової активності у білих щурів після гострого або хронічного опромінення та подальшого введення ембріональних стовбурових клітин кордової крові. У процесі статистичної обробки отриманих даних у кожній дослідній групі були сформовані дві підгрупи: перша - з тварин, які вижили в експерименті, а друга -із тварин, що загинули. Завдяки цьому нам вдалось чітко простежити закономірності в різниці імунного статусу та кінцевих результатів експерименту між двома підгрупами. Слід відмітити, що кількість тварин у других дослідних підгрупах (летальність серед яких дорівнювала 100%) складала приблизно 20-27% від загальної кількості тварин, яким здійснювали введення стовбурових клітин.

Як бачимо з табл. 1, опромінення призводило до зниження кількості елементарних грумінгових актів, тобто до пригнічення грумінгової активності, причому при гострому опроміненні це пригнічення було більш вираженим, ніж при хронічному.

Таблиця 1

Кількість елементарних грумінгових актів у щурів різних експериментальних груп

Групи тварин

Види елементарних актів грумінгу

 

умивання, е.г.а.

лизання, е.г.а.

чухання, е.г.а.

обтрушування, е.г.а.

інтактні

11,07±1,87

7,87±1,99

6,63±1,39

4,70±1,44

гостре опромінення (г.о.)

2,97±1,10*

2,55±1,00*

2,55±0,99*

1,24±0,69*

хронічне

опромінення (х.о.)

5,59±1,54*

3,93±1,15*

3,86±1,50*

2,14±0,99*

г.о.+ЕСК(1)

9,35±2,41

6,80±1,55

6,80±1,74

5,35±1,68

г.о.+ЕСК(2)

2,65±1,53*

1,80±0,97*

1,70±0,89*

1,15±0,73*

х.о.+ЕСК(1)

10,16±3,07

6,79±1,65

7,16±2,12

4,26±1,71

х.о.+ЕСК(2)

3,44±2,02*

3,00±2,12*

3,78±1,87*

1,78±1,42*

Примітка. * - р<0,05 при порівнянні з інтактними тваринами.

Після введення ЕСК у більшості тварин грумінгова активність поверталась до початкового рівня, але у випадку хронічного опромінення відновлення кількості елементарних актів грумінгу було повнішим.

Привертає до себе увагу той факт, що в невеликої кількості щурів після введення ЕСК грумінгова активність не тільки не відновлювалась, але й, навпаки, мала тенденцію до подальшого зниження. Візуально у цих тварин спостерігалось випадіння шерсті, а в деяких -й об'єктивне зниження ваги.

На рис. 1 наведено гістограму зміни загальної кількості актів грумінгу. Вона наочно демонструє вплив опромінення на грумінг, різницю цього впливу між гострим і хронічним опроміненням та вплив подальшого введення стовбурових клітин. Виявлено вірогідну різницю між значенням цього показника у тварин після гострого і хронічного опромінення. Також суттєво розрізняється загальна кількість актів грумінгу між підгрупами обох дослідних груп.е.г.а.

35 1 30 -

25 -

20 -

15 -

10 -

5 -0 ­30,27

І

28,30

28,37

15,52*

9,31*

7,30*

12,00*

інтактні

г.о.

х.о.

груп.

г.о.+ЕСК   г.о.+ЕСК  х.о.+ЕСК х.о.+ЕСК (1) (2) (1) (2)

Рис. 1. Зміна загальної кількості грумінгових актів у щурів різних експериментальних

Примітка. * - р<0,05 при порівнянні з інтактними тваринами.

На рис. 2 наведено загальний час, який щури витрачали на грумінг. Як бачимо, опромінення суттєво знижує і час грумінгу. Як і у випадку з кількістю грумінгових актів, час грумінгу більш за все знижувався у щурів, які піддавалися гострому опроміненню. Введення ЕСК приводило до відновлення рівня цього показника в більшості опромінених тварин, але були й такі, у котрих він був ще більш зниженим, ніж у контрольних груп.

180 160 140

120 Н-

100 80 60 40 20 0

1    155,30 1

62,2

t

 

-±~

140,30 т

і.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

81,03*

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

49,78*

 

 

4

+5,1 /' і І

 

 

 

 

35,70*

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

інтактні        г.о. х.о.        г.о.+ЕСК    г.о.+ЕСК    х.о.+ЕСК х.о.+ЕСК

(1) (2) (1) (2)

Рис. 2. Зміна часу грумінгу у щурів різних експериментальних груп. Примітка. * - р<0,05 при порівнянні з інтактними тваринами.

Якщо розглянути інтегральний показник інтенсивності грумінгу, ми не виявимо в ньому будь-яких вірогідних змін між інтактними та опроміненими щурами (рис. 3). Але це говорить лише про те, що співвідношення між загальною кількістю актів грумінгу і його часом було однаковим, що цілком зрозуміло в нашому випадку. Привертає до себе увагу той факт, що значення цього показника вірогідно зростають у щурів других дослідних підгруп, що можливо інтерпретувати як порушення стану комфортності, пов' язаного з погіршенням загального самопочуття.

с

35

29,15*

23,51*

00 on '

 

 

 

21,06 т

)

21,01

т

20,01

т

 

т

18,99

 

 

 

 

 

 

 

_|_

 

 

 

 

 

т

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

20

%

15

інтактні

г.о.

х.о.       г.о.+ЕСК   г.о.+ЕСК   х.о.+ЕСК х.о.+ЕСК (1) (2) (1) (2)

Рис. 3. Зміна інтенсивності грумінгу у щурів різних експериментальних груп. Примітка. * - р<0,05 при порівнянні з інтактними тваринами.

На відміну від попереднього показника, відсоток часу грумінгу повністю відображає виявлену нами тенденцію (рис. 4).

20

18 16 14

12 %10 8 6 4 2 0

-17,26 18,02

 

 

15,59

1

 

 

 

 

-t-

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

9,00*

 

 

 

 

 

 

 

—ї—

 

 

 

 

 

 

 

5,02*

 

 

 

 

 

5,53*

 

 

 

—ш—

 

 

 

 

3,97*

 

 

—£—

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

інтактні       г.о. х.о.      г.о.+ЕСК   г.о.+ЕСК  х.о.+ЕСК х.о.+ЕСК

(1)     (2)     (1) (2)

Рис. 4. Зміна відсотка часу грумінгу у щурів різних експериментальних груп. Примітка. * - р<0,05 при порівнянні з інтактними тваринами.

0

Кількість часу, який витрачали тварини на грумінг за період спостереження, знижувалась після опромінення й зростала до рівня інтактних тварин після введення ЕСК у перших підгрупах дослідних груп.

Особливу увагу привертає наступний показник. Загальна рухова активність щурів після гострого опромінення була більш ніж у три рази підвищеною у порівнянні з інтактними особинами. Хронічне опромінення також призводило до її зростання майже удвічі (рис. 5).

Проблеми екології та охорони природи техногенного регіону. - 2011. - № 1 (11).

 

 

 

 

 

9,65*

 

 

6 76*

г-Ь-

 

 

 

 

і

 

 

 

6,31* г-Е—

 

3,88

 

 

 

3,46

 

 

4,41 Г

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

14

12 10

8 6 4 2

0

інтактні       г.о. х.о.       г.о.+ЕСК   г.о.+ЕСК   х.о.+ЕСК х.о.+ЕСК

(1) (2) (1) (2)

Рис. 5. Зміна загальної рухової активності у щурів різних експериментальних груп. Примітка: * - р<0,05 при порівнянні з інтактними тваринами.

%

Введення ЕСК у більшості тварин відновлювало початковий рівень рухової активності, але у других підгруп дослідних груп це зниження було менш вираженим і, можливо, викликалося іншими механізмами.

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

Д Ю Кустов - Дослідження впливу трансплантації ембріональних стовбурових клітин на поведінку щурів після опромінення