И А Харчук - Жизнеспособность dunaliella salina в зависимости от условий обезвоживания и длительности хранения в состоянии ангидробиоза - страница 1

Страницы:
1  2 

УДК 582.261.2:579:577.1

И. А. Х А Р Ч У К

ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ DUNALIELLA SALINA В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ ОБЕЗВОЖИВАНИЯ И ДЛИТЕЛЬНОСТИ ХРАНЕНИЯ В СОСТОЯНИИ АНГИДРОБИОЗА

Изучена жизнеспособность Dunaliella salina в зависимости от условий обезвоживания и длитель­ности хранения в состоянии ангидробиоза Показано, что неинцистированные клетки D. salina со­храняют жизнеспособность в обезвоженном состоянии в течение 7 суток. Более длительное их хранение приводит к необратимым изменениям в клетках и потере способности восстанавливать жизнеспособность. Биохимические исследования зарегистрировали деструкцию пигментного ком­плекса. Зависимости инцистирования клеток от температуры обезвоживания, длительности дегид­ратации, остаточной влажности культуры после высушивания и времени хранения не выявлено. Во всех случаях цисты прорастали через 20 дней.

Ключевые слова: Dunaliella salina, жизнеспособность, ангидробиоз, цисты, биохимический состав.

Проблема длительного сохранения коллекционных штаммов микроводорослей актуальна как для научно-исследовательских учреждений, так и для предприятий био­технологической промышленности. Наряду с традиционными способами хранения штаммов применяется метод сохранения микроорганизмов в состоянии ангидробиоза. Это - простой, экономически выгодный и приближённый к естественным условиям ме­тод, т.к. ангидробиоз часто встречаемое природное явление. Однако перевод низших фототрофов в состояние обратимого, длительного торможения метаболизма требует до­полнительных экспериментальных исследований и адаптации данного метода для раз­ных видов микроводорослей. Известно, что зелёный микроводоросли способны образо­вывать цисты [3], но сохраняют ли они свою жизнеспособность в монадном состоянии при переводе в ангидробиоз? Такие данные в научных работах отсутствуют.

Цель работы - изучить жизнеспособность Dunaliella salina в зависимости от ус­ловий обезвоживания и длительности хранения в состоянии ангидробиоза.

Материал и методы. Объектом исследования была культура Dunaliella salina (штамм IBBS-1), выращиваемая в отделе биотехнологии и фиторесурсов ИнБЮМ НАН Украины.

Зелёные микроводоросли, к каковым относится Dunaliella salina, культивировали в накопительном режиме при постоянном круглосуточном освещении и автоматическом перемешивании среды с использованием насоса для удаления из неё избытка кислорода и равномерного прогрева всего слоя питательного раствора культуры. Интенсивность света на поверхности раствора составляла 8 кЛк. Температура среды колебалась в диа­пазоне 25 - 29 °С. В качестве питательного раствора использовали среду Ben-Amotz [7]. Её объём в культиваторах составлял 1 л, при высоте слоя раствора 15 см.

Эксперименты проводили в трёх вариантах: 1) клетки обезвоживали после цен­трифугирования; 2) капли культуры обезвоживали на покровных стёклах; 3) обезвожи­вание происходило путём испарения воды из культуральной среды. Во всех вариантах клетки подвергали дегидратации после выхода культуры на стационарную стадию роста.

В первом варианте концентрирование клеток проводили центрифугированием при 2500 об. мин 1 на центрифуге ОС-6М. Затем их обезвоживали в термостате при темпе­ратуре 30 - 60 °С. Длительность обезвоживания зависела от количества материала под­вергаемого дегидратации и колебалась от 25 мин до 72 ч. Остаточная влажность клеток варьировала в переделах 2,7 - 12,1 %. Дегидратированные культуры хранили в герметично

© И. А. Харчук, 2010

Экология моря. 2010. Спец. вып. 81закрытых полиэтиленовых упаковках, в темноте при температуре 15 - 20 °С. Влажность в обезвоженных культурах определяли стандартным методом доведения до постоянной мас­сы [4]. Длительность хранения образцов варьировала от 13 дней до 3-х лет.

Во втором варианте препараты культуры D. salina готовили на предметном стекле перед центрифугированием. Для этого 0,1 мл культуры помещали на предметное стекло, обезвоживали при комнатной температуре (21 - 24 °С). Препараты хранили в чашках Петри в темноте при той же температуре, при которой обезвоживали культуру.

В третьем варианте часть культуры обезвоживали вместе с культуральной средой. Для этого 10 - 20 мл культуры наливали в чашки Петри, помещали в термостат и дегид­ратировали при температуре 30 - 60 °С в течение 720 - 3600 ч. Длительность обезвожи­вания обусловлена моделированием естественных условий по температурному фактору. Высушенные таким способом образцы культуры хранили в герметично закрытых поли­этиленовых упаковках, в темноте при температуре 15 - 20 °С.

Для реактивации клеток в 1 и 3 вариантах эксперимента брали навеску культуры массой 0,02 г, увлажняли её средой Ben-Amotz, разбавленной в соотношении 1 : 1. Жиз­неспособность клеток определяли через 2 ч после увлажнения. Во втором варианте опы­тов средой Ben-Amotz, разбавленной в соотношении 1 : 1, увлажняли препарат обезво­женный на покровном стекле.

Сохраняемые образцы D. salina подвергали биохимическим исследованиям. Пробы обрабатывали по схеме комплексного химического анализа гидробионтов [2]. Содержание пигментов определяли спектрофотометрическими методами на приборе СФ-2000 [6]. Хлорофилл (ХЛ) а из клеток D. salina экстрагировали 90 % ацетоном; оп­тическую плотность полученных супернатантов регистрировали при 663 нм [6]. Кароти-ноиды (КР) оценивали в суммарной вытяжке пигментов D. salina по поглощению в об­ласти 480 нм [6]. Количество свободных нуклеотидов (СН), РНК и ДНК определяли спектрофотометрическим методом [5].

Результаты и обсуждение. Результаты экспериментов показали, что количество жизнеспособных, неинцистированных клеток D. salina зависит от времени пребывания в состоянии ангидробиоза (рис. 1 А). После реактивации клеток, пребывающих в состоя­нии ангидробиоза на протяжении 24 ч, высушенных на предметном стекле, доля живых неинцистированных клеток в монадном состоянии составляла 2 %, через 48 ч - 0,73 %,

2,5

О

S 2 с;

X

3 1,5 х ю о

0 1 с

о ф

1 0,5

0

о

А

y = -0,686x + 2,795 R2 = 0,9963

ч

5?

К

о

2.5 2

1.5 1

0.5 0 ^4Ґ

y = 0.8387e°"94x R2 = 0.6495

24     36     48     144    360    408 504 Время хранения, ч

жизнеспособные клетки, неинцистированные - Линейная аппроксимация

24     36     48    144   360   408 504 Время хранения, ч

цисты Экспоненциальная аппроксимация

Рисунок 1. Зависимость жизнеспособности клеток Dunaliella .salina от времени пребывания в состоянии ангидробиоза (А - доля жизнеспособных, неинцистированных клеток, Б - доля цист)

Figure 1. Dependence of viability of Dunaliella salina cells on residence time in anhydrobiosis state (A - a fraction of viable, not encysted cells, Б - a fraction of cysts)через 144 ч - 0,03 % общего количества клеток. При более длительном хранении доля жизнеспособных неинцистированных клеток снижался до 0 %.

А

Длительность обезвоживания, ч 24    24    24 24

2,5 2

1,5 1

0,5 0 12 10 8 6

4

2 0

2    1   0,6 0,1

Время хранения, г

Доля цист, %

Длительность обезвоживания, ч Б 12    12    24   24    3 0,25

9

о

3 2,5

° 1,5

5 1 0,5 0

8

♦ + 7

6

5 4 3 2 1 0

2    1 0,09 0,06 0,06

Время хранения, г

Остаточная влажность, %

Ф   Ф   Ф   Ф   Ф    Ф   Ф </^\»

Рисунок 2. Инцистирование клеток Dunaliella salina, обезвоженных при 30 °С (А) и 60 °С (Б) Figure 2. Encystation of Dunaliella salina cells dehydrated at 30 °С (А) and at 60°С (Б)

Во всех образцах культур, независимо от времени пребывания в состоянии ан-гидробиоза, были обнаружены цисты, доля которых составляла 0,7 - 2 % общего числа клеток (рис. 1 А, Б и рис. 4 А - В).

В экспериментах по обезвоживанию клеток D. salina после центрифугирования при 30 - 60 °С (рис. 2 А, Б) зависимости инцистирования клеток от температуры обез­воживания, длительности дегидратации, остаточной влажности культуры после высу­шивания и времени хранения образца не выявлено.

Реактивация неинцистиро-ванных клеток D. salina, переведён­ных в состояние ангидробиоза при разных условиях и сохраняемых в течении 3 лет, показала, что жизне­способные клетки отсутствуют. Од­нако, содержащиеся в пробах цисты прорастали через 20 дней от начала их реактивации (рис. 3). Сроки про­растания цист (рис. 4 Г) не зависели от температуры и длительности де­гидратации, а также от остаточной влажности культуры. Исключением была культура, обезвоженная вместе с кристаллизованной солью из пита­тельного раствора среды. Длитель­ность её обезвоживания составляла 5 мес при температуре 30 °С. Переход от покоящейся стадии прорастающих клеток к монадному состоянию про­длевался на 10 - 20 дней. Процесс прорастания показан на рис. 4 В-Ж.

s к

S

гз I—

о гз о. о о.

CZ

к о

.

4.3   7.9    9   11.6 12.1   14 0,63* 0,62* 0,45* 10

Остаточная влажность, %

ЕЗЗ Время хранения

-Время прорастания, дни

Рисунок 3. Прорастание цист Dunaliella salina в зависимости от сроков хранения и условий обез­воживания (* - хранение клеток вместе с солью из питательной среды)

Figure 3. A germination of Dunaliella salina cysts in dependence on a storage life and dehydration conditions (* - storage of cells together with salt from a nutritious medium)

и о г

га

ш

га z т о н га н о О

2

А

Рисунок 4. Образование и прорастание цист D. salina: А - клетка на стадии инцистирова-ния (х630*1,5), Б - сформированная циста (х630*1,5), В - инцистированные клетки D. salina (х630), Г - прорастание цист (х630), Д, Е - выход молодых клеток из капсулы (x630), Ж - молодые монадные клетки (x630) Figure 4. Formation and germination of D. sali-na cysts: A - cell at an encystation stage (x630x1,5), Б - generated cyst (x630x1,5), В -encysted D. salina cells (x630), Г - germination of cysts (x630), Д, Е - liberation of young cells from a capsule (x630), Ж - young monad cells

(x630)

ХЛ a     ХЛ b   ХЛ a + b    КР СН РНК ДНК

Нпосле обезвоживания   СИ год хранения

Рисунок 5. Содержание компонентов сухого вещества в клетках Dunaliella salina при дли­тельном хранении в состоянии ангидробиоза (доверит. интервал, при Р = 0,95) (ХЛ a - хло­рофилл а, ХЛ b - хлорофилл b, ХЛ a + b - сумма хлорофиллов a и b, КР - каротиноиды) Figure 5. Content of dry substance components in Dunaliella salina cells at long-time storage in anhydrobiosis state (confidence range, Р = 0,95) (ХЛ a - chlorophyll a, ХЛ b - chlorophyll b, ХЛ a + b - the sum of a chlorophyll a and b, КР - carotinoids)

Биохимические исследования дегидратированной культуры D. salina выявили, что при хранении происходит деструкция пигментного комплекса, при этом содержание ХЛ a снижается на 39 %, ХЛ b - на 72 %, а КР - на 87 % по сравнению с биохимически­ми показателями образцов до их закладки на хранение (рис. 5). Возможно, это связано с отмиранием клеток, как в процессе дегидратации, так и при последующим их хранении. В обезвоженной культуре D. salina через год пребывания в состоянии ангидробиоза об­наружено, что в образце отсутствовали неинцистированные жизнеспособные клетки. Из нуклеиновых кислот деструкции подверглась только ДНК, её доля снизилась на 58 % от исходной.

Согласно [1], жизнеспособность клеток после обезвоживания зависит от состоя­ния белоксинтезирующего аппарата, в частности, от содержания РНК. Для сохранения их жизнеспособности доля РНК должна быть не менее 60 % от первоначальной. В на­ших экспериментах содержание РНК в клетках не изменялось. Однако деструкция пиг­ментного комплекса, вероятно, связана с необратимыми изменениями в фотосистеме клеток и указывает на потерю восстановления жизнеспособности монадных клеток. В то же время инцистированные клетки переносят неблагоприятные условия и при измене­нии их в оптимальную сторону возобновляют жизненные процессы.

Заключение. Неинцистированные клетки Dunaliella salina сохраняют жизне­способность в обезвоженном состоянии в течение 7 сут. Более длительное их хранение приводит к необратимым изменениям в клетках и потере способности восстанавливать жизнеспособность. Биохимические исследования подтверждают деструкцию пигментно­го комплекса. Зависимости инцистирования клеток от температуры обезвоживания, дли­тельности дегидратации, остаточной влажности культуры после высушивания и времени хранения не выявлено. Во всех случаях цисты прорастали через 20 дней.

1. Бекер М. Е., Райпулис Е. П. Живая клетка и её жизнедеятельность / Бекер М. Е., Лиепиньш Г. К., Райпулис Е. П. Биотехнология. - М.: ВО Агропромиздат, 1990. - С. 7 - 41.

2. Копытов Ю. П., Дивавин И. А., Цымбал И. М. Схема комплексного биохимического анализа гидробионтов // Рациональное использование ресурсов моря - важный вклад в реализацию продовольственной программы: Мат. конф. - Севастополь, 1985. - C. 227 - 231.

3. Масюк Н. П. Морфология, систематика, географическое распространение рода Dunaliella Teod. и перспективы его практического использования - К.: Наук. думка, 1973. - С. 61 - 62.

4. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической прак­тике / Топачевский А. В. - К.: Наук. думка, 1975. - 247 с.

5. Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. - 1958. - 23, № 5. - С. 656 - 662.

6. Rowan K. S. Photosynthetic Pigments of Algae. - Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1989. -334 p.

7. Shaish A., Avron M., Ben-Amotz A. Effect of ingibitors on the formation of stereoisomers in the biosynthesis of P-carotene in Dunaliella bardawil // Plant. Cell. Physiol. - 1990. - 31, No 5. -

P. 689 - 696.

Институт биологии южных морей НАН Украины,

г. Севастополь, Украина Получено 14.04.2010 г.

I. А. Х А Р Ч У К

ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ DUNALIELLA SALINA В ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД УМОВ ЗНЕВОДНЕННЯ І ТРИВАЛОГО ЗБЕРІГАННЯ В СТАНІ АНГІДРОБІОЗУ

Резюме

Вивчено життєздатність Dunaliella salina залежно від умов зневоднення та тривалості зберігання в стані ангідробіозу. Показано, що неінцистовані клітини D. salina зберігають життєздатність у зне­водненому стані протягом 7 діб. Тривале їх зберігання призводить до незворотних змін в клітинах і до втрати здатності відновлювати життєздатність. Біохімічні дослідження зареєстрували дестру­кцію пігментного комплексу. Залежності інцистування клітин від температури зневоднення, три­валості дегідратації, залишкової вологості культури після висушування і часу зберігання не вияв­лено. Цисти проростали за 20 діб.

Ключові слова: Dunaliella salina, життєздатність, ангідробіоз, цисти, біохімічний склад

I. A. K H A R C H U K

DUNALIELLA SALINA VIABILITY DEPENDING ON DEHYDRATION CONDITIONS AND STORAGE PERIOD IN ANHYDROBIOSIS CONDITION

Summary

Dunaliella salina viability depending on dehydration conditions and storage period in an anhydrobiosis condition is studied. It is shown that not unencysted D. salina cells maintain viability in dehydrated state during 7 day. Their long-term storage leads to irreversible changes in cells and to loss of capacity to re­store viability. Biochemical researches have registered destruction of a pigmental complex. Dependence of cells encystation on temperature and duration dehydration, residual humidity of culture after drying and a storage time is not revealed. Cysts germinated in 20 days.

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

И А Харчук - Анабиоз основные понятия и сопровождающие его процессы

И А Харчук - Динамика компонентов биохимического состава spirulina platensis при ангидробиозе

И А Харчук - Жизнеспособность dunaliella salina в зависимости от условий обезвоживания и длительности хранения в состоянии ангидробиоза

И А Харчук - Химический состав красной микроводоросли porphyridium purpureum при переводе в состояние ангидробиоза