С П Антоненко, Т В Догадина, В П Комаристая - Изменчивость морфометрических признаков dunaliella salina в условиях культуры - страница 1

Страницы:
1  2 

УДК 582.264.1:577.161.1:581.133.(1+5)

С. П. А Н Т О Н Е Н К О, Т. В. Д О Г А Д И Н А, В. П. К О М А Р И С Т А Я

ИЗМЕНЧИВОСТЬ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ DUNALIELLA SALINA В УСЛОВИЯХ КУЛЬТУРЫ

Выявлена изменчивость размеров и формы, биохимических показателей Dunaliella salina в зави­симости от обеспеченности культуры азотом и фосфором. Рассматривается возможность исполь­зования этих признаков для индикации содержания биогенов в природных водоёмах.

Ключевые слова: морфометрические признаки, Dunaliella salina, азот, фосфор.

Основными диагностическими признаками для выделения видов рода Dunaliella являются наличие и тип стигмы, форма хлоропласта, расположение в клетке светопре­ломляющих гранул, а также форма и размер клетки. Выделение внутривидовых таксо­нов, подвидов и форм D. salina основано исключительно на морфометрических призна­ках [8]. Известно, что эти признаки в связи с отсутствием плотных клеточных оболочек у представителей рода Dunaliella характеризуются широкой амплитудой модификаци-онной изменчивости. В литературе имеются данные по влиянию солёности среды, pH, некоторых фитогормонов (гибберелловая кислота) на длину и ширину клеток D. salina [8 - 10]. Влияние концентраций биогенов на морфометрические признаки представите­лей рода практически не изучалось. Известно только, что истощение биогенов в старых культурах может приводить к изменению соотношения длины и ширины клеток [8]. Концентрации биогенов, в частности азота и фосфора, определяют трофность природ­ных водоёмов, которая может быть различной для разных водоёмов, в которых обитает D. salina. Данный вид встречается в гипергалинных водоёмах практически в монокуль­туре. Особенности морфологии, а точнее размеры, форма, соотношение длины и шири­ны клетки, этой водоросли водоросли могут иметь значение для индикации трофности гипергалинных водоемов, а также для индикации дефицита биогенов в культуре.

В задачи данной работы входило изучение и выявление зависимости размеров и формы клеток D. salina в условиях индукции каротиногенеза дефицитом азота и фосфо­ра, а также при различной обеспеченности культур этими биогенами.

Материал и методы. Объектом исследования была клоновая культура Dunaliel­la salina Teod., выделенная из штамма IBSS-1, который поддерживается в коллекции культур микроводорослей кафедры ботаники Харьковского Национального Университе­та на среде, приготовленной из морской соли (плотность среды 1,15 г см -3) без допол­нительного внесения биогенов [6]. Инокулят отбирали из культуры на стационарной фазе роста и высевали на среду, содержащую 116 г л -1 NaCl, 50 г л -1 MgSO4 . 7H2O (плотность среды 1,11 г см -3) и раствор микроэлементов (H3BO3 - 2 мг л -1; MnSO4 . H2O - 2 мг л -1; ZnSO4 . 7H2O - 0,025 мг л -1; CoCl2 . 6H2O - 0,015 мг л -1; FeSO4 . 7H2O - 5 мг л -1; CuSO4 . 5H2O - 0,08 мг л -1; (NH4)MoO4 - 0,03 мг л -1; №2ЭДТА - 5 мг л -1). Азот вносили в форме KNO3 в зависимости от варианта опыта (без внесения - исклю­чение азота, 20, 40 и 80 мг л фосфор - в форме KH2PO4 (без внесения - исключение фосфора, 4, 9 и 45 мг л Концентрации биогенов в среде в ходе культивирования поддерживали на относительно неизменном уровне, как описано [7]. Культуры выращи­вали в течение 42 суток в колбах Эрленмейера объёмом 25 мл, по 15 мл культуры в кол­бе, при круглосуточном освещении интенсивностью 5 кЛк от 4 ламп «Maxus» с цветовой температурой 2700 K мощностью 32 Вт, температура 24 - 28 °С. Эксперимент повторяли 3 раза.

В каждом варианте измеряли длину и ширину 100 живых подвижных клеток при помощи окуляр-микрометра. Клетки перед измерением не фиксировались во избежание

© С. П. Антоненко, Т. В. Догадина, В. П. Комаристая, 2010

Экология моря. 2010. Спец. вып. 81искажения формы и размеров клеток [8]. Форму клеток аппроксимировали вытянутым сфероидом, или, в случае равенства длины и ширины, шаром [4].

Площадь поверхности клеток каплевидной формы вычислялась по формуле:

S = Р  d ■ [d + h  arCSirip)j,

где S - площадь поверхности клетки, мкм2; d - диаметр сфероида, мкм; h - высота сфе­роида; мкм, p - радиус кривизны сфероида

Vh2 - d2

Объём таких клеток (V, мкм3) определяли по формуле:

V = Р- d2 h .

6

Площадь поверхности сферических клеток определяли по формуле: S = pd2,

где S - площадь поверхности шара, мкм2; d - диаметр шара, мкм. Объём сферических клеток (V, мкм3) определяли по формуле из [4]:

V = Р d3.

6

Индекс формы клеток определяли по формуле: со = 4,836- V0.661/S,

где о - индекс формы; V- объем клетки, мкм3; S - площадь поверхности клетки, мкм2.

Для определения концентрации р-каротина аликвоты центрифугировали при 3 тыс. об. мин -1. Осадки клеток экстрагировали этилацетатом. Оптическую плотность экстрактов определяли при 440 нм. Содержание р-каротина рассчитывали, используя удельный коэффициент экстинкции E1%1cm = 2500 [13]. Содержание р-каротина выража­ли в пг на клетку водорослей. Число клеток измеряли подсчетом в камере Горяева. Ди­намика роста культур приведена в работе [7]. Статистическую обработку данных прово­дили методом дисперсионного анализа. Обсуждаемые в тексте различия достоверны на уровне значимости 95 %.

Результаты и обсуждение. Разные авторы описывают форму клетки D. salina как каплевидную, эллипсоидную, овальную, яйцевидную, грушевидную, удлиненно-яйцевидную, удлиненно-эллипсоидную, удлиненно-цилиндрическую, иногда шаровид­ную, цилиндрическую или веретеновидную, изредка асимметричную [3 - 5, 8].

Форма и размеры клеток D. salina могут изменяться в зависимости от солёности среды. Ещё Е. Теодореско, а впоследствии В. Лерхе отмечали округление клеток, то есть уменьшение отношения длины к ширине, как типичную реакцию на опреснение среды, а удлинение клеток - увеличение отношения длины к ширине - характерным ответом на повышение её концентрации [8]. Исследования природных вод подтвердили эти наблю­дения. В период паводка в планктоне Чёрного моря встречаются клетки измененной, округлой формы, при солёности вод на поверхности моря 17,99 0/00 клетки D. salina имеют яйцевидную форму и длину 8 - 10 мкм, ширину 6 - 8 мкм, а при солёности 18,1 0/00 клетки, сохраняя яйцевидную форму, увеличиваются в размерах: длина 8 - 14 мкм, а ширина 5 - 10 мкм. В гипергалинных водоёмах клетки достигают максимальных размеров: длина от 11 до 27 мкм, а ширина от 5 до 19 мкм [11].

Образование шаровидных форм, равно как веретеновидных, асимметричных или форм с оттянутыми концами, является неспецифической ответной реакцией на неблаго­приятные условия среды. Изучение влияния рН на форму клеток D. salina показало не­специфическую реакцию округления клеток при рН 3,0; 4,0; 5,0 [10]. Согласно наблюде­ниям Н. П. Масюк, также изменяется форма клеток этого вида и при внесении субле­тальных концентраций гиббереловой кислоты в питательную среду [9].

Однако, несмотря на широкую модификационную изменчивость, форма клеток является устойчивым к мутагенезу признаком. Эксперименты с воздействием сильных мутагенов (нитрозометил мочевина, ультрафиолетовые и рентгеновские лучи) не приве­ли к наследственному закреплению изменения формы клеток [12].

Типичная, специфическая для многих видов Dunaliella форма клеток может проявляться лишь в молодых культурах на фоне условий, благоприятных для их роста. При этом для определения вида следует учитывать не только типичную форму, прояв­ляющуюся в оптимальных для роста и развития условиях, но и норму реакции вида на изменение этих условий.

В диагнозе вида для D. salina приводятся такие данные: длина - 12 - 28 мкм, ширина - 9,5 - 17 мкм [5]. В своем описании Н. П. Масюк [8] для вида D. salina приво­дит более широкий интервал размеров: длина клеток 5 - 29 мкм, ширина - 3,8 - 20,3 мкм; а для лабораторной культуры D. salina, выращенной на ОПС при освещённости 5 -6 кЛк и температуре 28 ± 2 °С, длина клеток варьирует в пределах (3,8) - 5,1 - 22,9 мкм; ширина - 3,8 - 20,3 мкм [8]. По нашим данным, размеры клеток, выращенных на средах с различным содержанием биогенов, не выходят за пределы диапазона, указанного Н. П. Масюк.

В коллекции ИнБЮМ штамм IBSS-1, выращенный на среде Ben-Amotz, облада­ет шириной 9,38 ± 0,42 мкм и длиной (максимальный размер) 12,48 ± 0,49 мкм [4]. Пре­делы варьирования в наших экспериментах для данного штамма составляли: ширина -10,06 ± 0,034 мкм, длина - 13,49 ± 0,035, что несколько превышает таковые, приведен­ные для коллекционной культуры ИнБЮМ.

Нами установлено, что концентрации азота и фосфора значимо влияют на мор-фометрические показатели клеток. Так, наибольшую среднюю длину, 15 - 16 мкм, име­ли клетки, выращенные на среде при дефиците фосфора (рис.1). Добавление фосфора в среду вызывало заметное уменьшение длины клеток, исключение составляют лишь клетки, выращенные при полном дефиците азота с добавлением 9 мг • л -1 KH2PO4, длина которых также достигала 15 мкм. Минимальную длину (11,5 мкм) имели клетки, выра­щенные на среде с добавлением 45 мг • л -1 KH2PO4 на фоне полного дефицита азота. Во всех остальных вариантах длина клеток составляла 12 - 13 мкм (рис. 1).

Наибольшую среднюю ширину 11 - 12 мкм имели клетки, выращенные при де­фиците и при избытке фосфора. Исключение составляли варианты с концентрацией ис­точника азота 40 мг • л -1, а также клетки в варианте с минимальной длиной - при дефи­ците азота и избытке фосфора. Во всех остальных вариантах ширина клеток составляла 8 - 10 мкм (рис. 1).

Полученные данные отчасти подтверждают общее наблюдение, что мелкокле­точные формы делятся быстрее крупноклеточных [14]. Как показано ранее, дефицит фосфора, а также внесение KH2PO4 в концентрации 45 мг • л -1 ингибируют рост культу­ры по сравнению с вариантами, в которых концентрация источника фосфора составляла 4 - 9 мг • л -1, а концентрации источника азота 20 - 80 мг • л -1 [7].

Таким образом, длина и ширина клеток могут служить показателями обеспечен­ности культуры фосфором: «длинные» и «широкие» клетки характерны для дефицита фосфора, «короткие» и «широкие» - для избытка фосфора (в присутствии азота), «ко­роткие» и «узкие» - для нормальной обеспеченности культуры биогенами. Для различ­ной обеспеченности культуры азотом столь четких закономерностей не выявлено.

Клетки всех исследованных культур довольно неоднородны по размерам и фор­ме, об этом свидетельствует размах вариации на рис.1. Распределение данных обладает асимметрией. Особенно велика положительная асимметрия для культур с довольнокрупными средними размерами и наличием обоих биогенов в среде культивирования (источников фосфора в различных концентрациях на фоне 20 и 80 мг л -1 KNO3, а также 45 мг л -1 KH2PO4 и 40 мг л -1 KNO3). Такое распределение может быть связано с дей­ствием какого-то фактора, вызывающего изменение распределения в сторону крупных клеток в остальных культурах, где клетки сохраняют довольно крупные размеры и вы­сокое содержание каротина.

СП

о

се о 20

80

§ 20

 

V=833,1±25,7

 

 

S=432,9+7.7

40

 

і і

4

 

0 4

8    12   16 20

 

V=811,5+41,5 S=406,1+11,1

 

 

 

J

: 4

8    12   16 20

 

V=567,3+12,9 S=334,0+4,9

) 4

8    12   16 20

=598,0+14, £ =344,6+5,6

 

V=895,3+27,8

 

" S=437,3+9 1

 

 

V

і

 

V=991,7+29,7

 

S=468,7+9,4

я

j

4

8   12   16 20

 

45

Ширина клеток, мкм 0 4 9

Концентрация KH2PO4, мг л -1

Рисунок 1. Размеры клеток Dunaliella salina при разных концентрациях источников азота и фосфора в среде (V - объём клеток, мкм3, S - площадь поверхности клеток, мкм2) Figure 1. Size of Dunaliella salina cells under different concentrations of nitrogen and phospho­rus sources in the medium (V - volume of cells, mkm3, S - surface area of cells, mkm2)

Клетки, выращенные при дефиците фосфора, характеризовались также наи­большим объёмом и площадью поверхности, чуть меньше были объём и поверхность клеток, выращенных при избытке фосфора (кроме варианта с дефицитом азота) (рис. 1). Остальные варианты характеризовались меньшими значениями объёма и площади по­верхности клеток (рис. 1). В паспорте штамма IBSS-1 приведены такие данные: средний объём клетки - 552,01 ± 56,37 мкм3; площадь поверхности - 327,67 ± 22,25 мкм2 [3]. В наших исследованиях значения объёма и площади поверхности штамма IBSS-1 до двух раз превышают приведенные в паспорте.

Для одноклеточных водорослей, поглощающих питательные вещества всей по­верхностью клетки, увеличение площади поверхности ведет к повышению поглотитель­ной эффективности, На ряде видов диатомовых водорослей показано, что уровень по­

лощения 14С-меченого СО2 был пропорциональным площади клеточной поверхности [14]. Но увеличение площади поверхности клетки также неразрывно связано с увеличе­нием объёма. Известно, что отношение площадь поверхности/объём коррелирует с ин­тенсивностью поглощения веществ и их использованием для роста клетки.

Таблица 1. Соотношения объёма и площади поверхности, длины и ширины и индекс формы клеток Dunaliella salina, выращенных при различных концентрациях источников азота и фосфора, на 42 сутки культивирования

Table 1. The ratios of volume and surface area, length and width and shape index of Dunaliella salina cells, grown under different concetrations of sources of nitrogen and phosphorus by 42 days of cultivation

 

 

S/V

0,494±0,005

0,605±0,006

0,575±0,007

0,699±0,005

 

0

l/d

1,373±0,016

1,368±0,021

1,616±0,020

1,491±0,019

 

 

CO

0,982561±0,0012

0,981025±0,0016

0,963112±0,0016

0,972691±0,0015

 

 

S/V

0,488±0,004

0,575±0,007

0,593±0,007

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

С П Антоненко, Т В Догадина, В П Комаристая - Изменчивость морфометрических признаков dunaliella salina в условиях культуры