Д В Бородин - Стимуляция биолюминесценции морских динофлагеллят - страница 1

Страницы:
1  2 

УДК: 591.148:582. 276:57. 084(26)

Д. В. Б О Р О Д И Н

СТИМУЛЯЦИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ МОРСКИХ ДИНОФЛАГЕЛЛЯТ:

АНАЛИЗ МЕТОДОВ

Рассмотрены различные способы возбуждения биолюминесценции морских динофитовых водорослей. Описаны методы химической, электрической, световой ультразвуковой и механической стимуляции светоизлучения планктонных биолюминесцентов. Проанализированы достоинства и недостатки существующих методов. Сделан вывод о необходимости их комбинирования при комплексном исследовании биолюминесценции.

Биолюминесценция морских вод - широко известное явление, имеющее планетарные масштабы [3]. Для многих районов Мирового океана показано, что основной вклад в создание поля биолюминесценции вносят планктонные динофлагелляты родов Noctiluca, Pyrocystis, Protoperidinium, Gonyaulax, Ceratium. Так, свечение вод Черного моря в значительной мере обусловлено гетеротрофной динофлагеллятой Noctiluca scintillans [1], а также водорослями родов Gonyaulax и Ceratium [2].

Светоизлучение перидиней реализуется в форме ярких вспышек, возникающих в ответ на какое-либо внешнее раздражение (изменение рН, температуры, давления, в естественных условиях основная роль принадлежит механическим стимулам), а у ряда автотрофных видов - также в форме редких спонтанных вспышек и постоянного низкоуровневого свечения (глоу) [18]. Тем не менее, именно вспышки, возникающие в ответ на стимуляцию, наиболее выпукло характеризуют биолюминесцентную способность организма, зависящую, в свою очередь, от его физиологического состояния.

Для получения светового отклика биолюминесцента возможно использование различных стимулов (световых, термических, ультразвуковых), но наиболее широкое распространение в практике лабораторных исследований получили химический, электрический и механический способы стимуляции. При этом перед исследователем зачастую встает вопрос о правомочности использования того или иного способа. Для этого необходимо знать достоинства и недостатки каждого из них. С этой точки зрения появление данного обзора является закономерным.

Химический метод стимуляции - один из самых простых и доступных, не требующих дополнительного оборудования, кроме фоторегистрирующего. В общем случае метод сводится к введению в прозрачную кювету с подопытным организмом небольшого количества (0,3 - 1 мл) того или иного химического реагента концентрация которого превышает 10%. В качестве такового возможно использование спирта, формалина, ацетона, перекиси водорода, йода, аммиака, уксусной и других кислот, солей различных металлов [4, 3, 5, 9, 19, 20, 25]. Считается, что такие агенты как спирт, формалин, уксусная кислота, ацетон не обладают специфичностью действия на биофизические характеристики светового сигнала [4], однако для солей различных металлов ситуация иная [15, 22]. На длительность светового отклика биолюминесцента оказывает влияние и концентрация химического вещества: чем выше концентрация реагента, тем продолжительнее светоизлучение [4, 5].

К преимуществам данного метода можно отнести высокую степень надежности: химические стимулы приводят к эффекту светоизлучения даже тогда, когда другие методы не дают необходимого результата. При этом энергия световой вспышки, как правило, максимальна. Поэтому этот способ возбуждения светоизлучения может дать представление о биолюминесцентном потенциале организма. Он также широко используется для каталогизации видов-биолюминесцентов и при изучении спектральных характеристик свечения.

В то же время следует отметить, что в результате действия химических реагентов организм чаще всего гибнет, что является очевидным недостатком метода. К недостаткам следует отнести и возникновение механического возбуждения при впрыскивании того или иного химического вещества, что делает невозможным

 

 

© Бородин Д. В., 2002 Экология моря. 2002. Вып. 60разделить механический и химический стимулы при низкой концентрации реагента. Кроме того, при воздействии химическими стимулами очень сложно зафиксировать время начала раздражения; точная регистрация хронаксии, реобазы и т.д. при этом значительно затруднена. Таким образом, химический метод стимуляции, будучи одним из основных методов изучения биолюминесцентных реакций организмов, все же не может предоставить исчерпывающей информации обо всем многообразии таких реакций.

Электрический метод стимуляции, несмотря на очевидную неадекватность естественным раздражителям, имеет единую с ними физиологическую основу (деполяризация клеточных мембран и генерация потенциала действия) и поэтому с успехом применяется отечественными и зарубежными исследователями [5, 6]. Электрическая стимуляция позволяет подобрать необходимые параметры раздражающих импульсов, как по величине, так и по длительности, изучить латентный период вспышек, довольно точно проследить динамику биолюминесцентных сигналов, а также исследовать период восстановления субстрата в случае неповреждающих величин тока. Раздражение организмов производится либо разрядом конденсатора, либо от стимуляторов электронного типа, работающих в режиме постоянного тока.

Различают внутреннюю электрическую стимуляцию, когда электроды вводятся непосредственно в клетку [13], и внешнюю, когда организм помещается между двумя электродами [6]. В первом случае при пропускании гиперполяризующего стимула через электроды на мембране возникает потенциал действия, и клетка генерирует световую вспышку. Однако применение внутриклеточных электродов сопровождается рядом методических трудностей. Во-первых, необходимо обездвижить организм, а это достаточно трудоемко и не позволяет быстро отснять биолюминесцентные характеристики. Во-вторых, введение микроэлектродов повреждает организмы. В-третьих, этот метод пригоден лишь для работы со сравнительно крупными клетками динофлагеллят. Поэтому чаще применяется метод внешней стимуляции как более простой. При этом плотность тока в разных точках рабочей камеры должна быть одинакова, что достигается ее формой.

Наиболее удачной является кювета, представляющая собой сосуд из прозрачного материала прямоугольной формы, причем металлические электроды находятся на двух противоположных стенках сосуда и равны им по площади [5]. Такое расположение электродов обуславливает наличие плоско-параллельного поля, позволяющего вычислять плотность тока при различных значениях силы тока импульса. К сожалению, и такая конструкция рабочей камеры не избегла общего недостатка всех камер для электрической стимуляции: при увеличении плотности тока происходит поляризация электродов и искажение поля в кювете. Кроме того, вода является хорошим проводником, а клетка обладает высоким сопротивлением, что вызывает эффект огибания (шунтирования) организма и порождает неудачные попытки стимуляции заведомо биолюминесцентных организмов.

Хикман с соавторами [16] попытались применить источник когерентного света для стимулирования биолюминесценции динофлагеллят. В эксперименте использовался лазер с длиной волны 560 ± 30нм. Световой пучок фокусировался линзой до 2 - 3 мм в диаметре, энергетическая плотность составляла 0,89 Джсм-2. Суспензия, содержащая клетки крупной динофлагелляты Pyrocystis lunula, демонстрировала яркую биолюминесценцию в ответ на световое раздражение. Тем не менее, сами же предложившие метод исследователи отметили, что неизвестно, является ли свечение организмов реакцией на лазерный импульс или же возбуждающим биолюминесценцию фактором служит ультразвук, возникающий при взаимодействии лазерного луча с водой, или же оба эти фактора действуют сообща.

Были предприняты попытки использовать акустические колебания ультразвукового диапазона для получения световых откликов организма. Так, Уайддер и Кэйз [26] стимулировали одиночные клетки динофлагеллят ультразвуком, используя при этом пьезокерамический кристалл, подведенный непосредственно к клетке. В. С. Филимо­нов и Н. А. Тюлькова [7] применяли в качестве раздражителяультразвуковые импульсы частотой 830 кГц. Излучатель позволял изменять интенсивность импульса в пределах от 0,02 до 2,00 Вт-см-2, а длительность - от 1 мс до сколь угодно большого временного промежутка. Раздражение подавалось от импульсного генератора. Однако при этом, во-первых, метод применим лишь при работе с достаточно крупными объектами и только для единичных клеток, во-вторых, нельзя говорить о моделировании природных процессов.

Наиболее адекватным природным стимулам методом исследования светоизлучения динофлагеллят является механическое возбуждение биолюминесценции. Этот метод является также основой измерений биолюминесценции in situ [3]. В океане способные вызвать световой отклик организма перемещения жидкости возникают при перемешивании водных масс во время штормов, плавании крупных животных (рыб, морских рептилий и млекопитающих), а также резких бросках копепод на добычу. В лабораторных же условиях метод сводится к созданию тока воды в сосуде с биолюминесцентом с помощью какого-либо электромеханического устройства. Возникающие при перемещении воды изменения гидрофизических характеристик приводят к деформации клеточной мембраны изучаемого организма, которая в свою очередь индуцирует возникновение потенциала действия, и, как следствие, светоизлучения.

Чувствительность многих динофлагеллят к механическим стимулам имеет выраженную циркадную ритмику [3, 4]. Хорошо проявлен при механической стимуляции и эффект фотоингибирования [4, 24], поэтому метод используют при изучении суточной периодичности биолюминесцентных реакций и влияния света на них.

Впервые установка для механической стимуляции была предложена в работе Николя [21]. Кювета с организмом приводилась в резкое движение электромагнитной системой громкоговорителя. Такая установка позволяла фиксировать начало стимуляции, но инерционность ее была велика. Схожую установку применяли сотрудники института физики Сибирского отделения АН СССР [4]. В кювете для механической стимуляции находилась легкая пластинка из оргстекла, способная перемещаться в вертикальном направлении. Пластинка гибким стержнем сообщалась с мембраной микрофона. Питание микрофона осуществлялось от генератора с регулируемым диапазоном частот и амплитудой напряжения. Несмотря на то, что интенсивность механического раздражения варьировала в достаточно широких пределах, эта система обладала высокой инерционностью, не могла обеспечить силу раздражения, необходимую для полного высвечивания организмов, световой ответ возникал не на каждый стимул, количество давших биолюминесцентный отклик клеток не превышало 70% даже в случае непрерывной стимуляции.

Ряд исследователей [9] пробовали стимулировать организмы путем пропускания пузырьков воздуха сквозь культуру клеток-биолюминесцентов. Однако этот метод не получил широкого распространения, поскольку, что дозировать воздействие по силе и длительности не представляется возможным; максимальное же значение биолюминесценции при этом не достигается никогда.

Довольно удачную установку для механической стимуляции предложили Бигглей с соавторами [9]. Она представляла собой U-образный стержень, присоединенный к электромотору и погруженный в сосуд с суспензией клеток. Вращение стержня вокруг вертикальной оси (1800 об./мин.) обеспечивало перемешивание суспензии и возникновение биолюминесценции. В дальнейшем многие исследователи применяли такую установку [10, 14, 20, 25] или ее различные модификации: вместо U-образного стержня использовались специальные лопатки [11], проволока [24], пропеллер [19]. Такой тип установки позволяет устанавливать время воздействия и достигать предельно возможных показателей светоизлучения, однако подсчитать силу воздействия тока жидкости на организм во всех модификациях этой установки очень сложно, и это составляет ее основной недостаток.

В дальнейшем исследователи совершили ряд попыток создать систему механической стимуляции, позволяющую дозировать воздействие на организм. Одной

из таких попыток стало устройство для вакуумной стимуляции биолюминесценции (рис.1) [17]. В основании прозрачной камеры находится отверстие, через которое с помощью вакуумного насоса удаляется вода. Там же имеется фильтр, препятствующий удалению планктонных организмов. Светоизлучение возникает при контакте влекомых водой биолюминесцентов с фильтром. И хотя скорость удаления воды может регулироваться, полностью избежать недостатков, присущих методу, предложенному в работе [9], не удалось.

Другой попыткой создать систему, воздействие которой адекватно природным стимулам и в то же время легко контролируется экспериментатором, явилась установка, предложенная Кристиансон и Свиней [12]. Основная ее часть представляет собой пластиковую трубочку-капилляр с отверстием 0,86 мм, закрученную в спираль перед фотокатодом (ФЭУ). Один из концов трубочки сообщается с сосудом, в котором содержатся планктонные биолюминесценты, другой свободен.

Течение жидкости, вызывающее свечение живых организмов, в такой трубочке ламинарное. Его скорость наиболее высока в центре и приближается к нулю у стенок. Таким образом, каждая клетка подвержена одинаковому по силе воздействию, которое легко подсчитываемо. Дальнейшие исследования показали, что основным стимулом в этом случае служит центростремительное ускорение, возникающее при входе в капилляр. К сожалению, такая установка позволяет контролировать лишь силу воздействия тока жидкости. Кроме того, существует опасность засорения капилляра клетками динофлагеллят.

Андерсон с соавторами [8] использовали устройство, в котором источником возбуждения являлось изменение давления и скорости тока жидкости. Для этого две пипетки Пастера были спаяны тонкими концами, в результате чего получился тонкий капиллярный канал. Одна из пипеток сообщалась с резервуаром, заполненным суспензией динофлагеллят, другая - с вакуумным насосом. Светоизлучение возникало при прохождении клетки сквозь капилляр в результате гидродинамического удара. Скорость тока жидкости регулировалась с помощью вакуумного насоса. Те же исследователи изготовили камеру, в которой свечение возникало в результате резкого изменения давления. Прямоугольная камера закрывалась сверху подвижным поршнем. При падении груза на поршень ударная волна возбуждала биолюминесценцию. Однако в этом случае светится не весь объем суспензии клеток, а только области, прилегающие к поршню и противоположной стенке.

Рохр с соавторами [23] удалось добиться биолюминесценции планктонных проб, содержащих значительное количество динофлагеллят, в результате воздействия на них сначала ламинарным, а затем и турбулентным током жидкости. В их экспериментах использовалась модифицированная установка Рейнольдса, обычно применяемая для изучения турбулентного течения жидкости. Она представляла собой прямоугольный аквариум, заполненный водой, и полую стеклянную трубку, одним концом соединенную с дном аквариума. Переход от ламинарного тока к турбулентному оценивался визуально. При этом было отмечено резкое усиление биолюминесценции во время такого перехода.

Для исследования влияния сдвигового напряжения жидкости биолюминесценцию оригинальную установку предложили Лац с соавторами [18].

Тестовая камера представляла собой два цилиндра, вставленных один в другой и способных вращаться вокруг своей оси (рис.2). Оба цилиндра были соединены с электромотором. Полость между цилиндрами заполнялась суспензией клеток биолюминесцентов. При вращении прозрачного внешнего цилиндра, в то время как внутренний остается неподвижен, в полости возникает ламинарный ток жидкости, за счет чего достигается определенное значение напряжения сдвига, что приводит к возбуждению биолюминесцентов. Скорость вращения внешнего цилиндра при этом могла быть изменяема и измерялась тахометром. Преимуществом этой и предыдущей систем стимуляции является возможность довольно точно оценить силу воздействия тех же стимулов, что имеют место in situ. Тем не менее, и в таких установках ток жидкости остается стационарным, в то время как в океане сдвиговое напряжение жидкости постоянно варьирует по величине и направлению.

В заключение следует отметить, что большинство механических устройств для стимуляции планктонных биолюминесцентов не позволяют получать световые отклики единичных клеток динофлагеллят. При работе же с суспензией невозможно зафиксировать форму светового импульса, которая является чувствительным параметром внешних воздействий [4].

Подытоживая все вышесказанное можно отметить, что использование того или иного метода в значительной мере определяется теми целями, которые ставит перед собой исследователь. Так, для получения информации о биолюми­несцентном потенциале организма следует воспользоваться химической стимуляцией, при изучении биологических ритмов -механической, а для установления длитель­ности латентного периода биолюми­несцентной    вспышки -электрической.

Комплексное же исследование биолюми­несцентных реакций морских динофитовых водорослей требует применения всех трех методов. Вероятно, появление приборов, конструкция которых позволит совмещать различные методы стимуляции и проводить при этом интегрированную оценку различных биолюминесцентных параметров - дело недалекого будущего.

1.     Битюков Э. П. Распределение и экология Noctiluca miliaris в Черном море // Биология моря. -Киев: Наук. думка, 1969. - Вып. 17. - С. 76 - 95.

2.     Битюков Э. П., Евстигнеев П. В., Токарев Ю. Н. Светящиеся Dinoflagellata Черного моря и влияние на них антропогенных факторов // Гидробиол. журн. - 1993. - 29. - С.27 - 34.

3.     Гительзон И. И., Левин Л. А., Утюшев Р. Н. Биолюминесценция в океане // С.-Петербург: Гидрометеоиздат, 1992. - 282 с.

4.     Гительзон И. И., Чумакова Р. И., Филимонов В. С. и др. Биолюминесценция в море // Москва: Наука, 1969. - 183 с.

5.     Евстигнеев П. В., Битюков Э. П. Биолюминесценция морских копепод // Киев: Наук. думка, 1990. - 144 с.

6.     Токарев Ю. Н., Соколов Б. Г., Рыжов Н. Н. Изменение характеристик биолюминесценции черноморской ночесветки под действием гамма-облучения // Экология моря. - 1982. - Вып. 9. -

С. 89 - 94.

7.     Филимонов В. С., Тюлькова Н. А. Характеристики биолюминесцентных импульсов одиночных клеток динофлагеллят // Биология моря. - 1981. - 3. - С. 43 - 50.

8.      Anderson M. D., Nosenchuck D. M., Reynolds G. T., Walton A. J. Mechanical stimulation of bioluminescence in the dinoflagellate Gonyaulaxpolyedra (Stein) // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. - 1988. -122. - P. 227 - 288.

9.      Biggley W. H., Swift E., Buchanan R. J., Seliger H. H. Stimulable and spontaneous bioluminescence in the marine dinoflagellates, Pyrodinium bahamense, Gonyaulax polyedra, and Pyrocystis lanula // J. Gen. Physiol. - 1969. - 45. - P. 96 - 122.

10.  Buskey E. J. Growth and bioluminescence of Noctiluca scintillans on varying algal diets // J. Plankt. Res. - 1995. - 17, №1. - P. 29 - 40.

11.  Buskey E. J., Storm S., Coulter C. Bioluminescence of heterotrophic dinoflagellates from Texas coastal waters // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. - 1992. - 159. - P. 37 - 49.

12.  Christianson R., Sweeney B. M. Sensitivity to stimulation a component of circadian rhythm in luminescence in Gonyaulax polyedra // Plant Physiol. - 1972. - 49. - P. 994 - 997.

13.  Eckert R. The wave form of luminescence emitted by Noctiluca // J. Gen. Physiol. - 1967. - 50, №9. - P. 2211 - 2237.

14.  Esaias W. E., CurlH. C., Seliger H. H. Action spectrum for a low intensity, rapid photoinhibition of mehanically stimulable bioluminescence in the marine dinoflagellates Gonyaulax catenella, G. acatenella, G. tamarensis // J. Cell. Physiol. - 1973. - 82. - P. 363 - 72.

15.  Hamman J. P., Seliger H. H. The chemical mimicking of the mechanically stimulation, photoinhibition, and recovery from photoinhibition of bioluminescence in marine dinoflagellate Gonyaulax polyedra // J. Cell. Physiol. - 1982. - 111. - P. 315 - 319.

16.  Hickman G. D., Edmonds J. A., Lynch R. V. Laser-induced marine bioluminescence measurements and the potential for airborne remote sensing // Remote Sens. Environ. - 1984. - 15, №1. - P. 77 -

89.

17.  Lapota D., Losee J. R Observation of bioluminescence in marine plankton from the Sea of Cortez // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. - 1984. - 77. - P. 209 - 240.

18.  Latz M. I., Case J. F., Gran R. L. Excitation of bioluminescence by laminar fluid shear associated with simple Couette flow // Limnol. Oceanogr. - 1994. - 39, №6 - P. 1424 - 1439.

19.  Latz M. I., Lee A. O. Spontaneous and stimulated bioluminescence of the dinoflaagellate Ceratocorys horrida (Peridiniales) // J. Phycol. - 1995. - 31. - P.120 - 132.

20.  Li Y., Swift E., Buskey E. J. Photoinhibition of mechanically stimulable bioluminescence in the heterotrophic dinoflagellate Protoperidinium depressum (Pyrrophyta) // J. Phycol. - 1996. - 32. - P.

974 - 982.

21.  Nicol J. A. C. Observation on luminescence of Noctiluca // J. Mar. Biol. Ass. UK - 1958. - 37. - P.

535 - 549.

22.  Okamoto K. O., Shao L., Hastings J. W., Colepicolo P. Acute and chronic effects of toxic metals on viability, encystment and bioluminescence in the dinoflagellate Gonyaulax polyedra // Comp. Biochem. Physiol. Part C - 1999. - 123. - P. 75 - 83.

23.  Rohr J., Losee J., Hoyt J. Stimulation of bioluminescence by turbulent pipe flow // Deep-Sea Research. - 1990. - 37. - P. 1639 - 1646.

24.  Sullivan J. M., Swift E. Photoinhibition of mechanically stimulable bioluminescence in the autotrophic dinoflagellate Ceratium fusus (Pyrrophyta) // J. Phycol. - 1994. - 30. - P. 627 - 632.

25.  Swift E., Biggley W. H., Seliger H. H. Species of oceanic dinoflagellates in the genera Dissodinium and Pyrocystis : Interclonal and interspecific comparisons of the color and photon yield of bioluminescence // J. Phycol. - 1973. - 7. - P. 89 - 96.

26.  Widder E. A., Case J. F. Bioluminescence excitation in dinoflagellate / K. H. Nealson (ed.), Bioluminescent current perspectives. - Burgess, 1981. - P. 125 - 132.

Институт биологии южных морей НАН Украины,

г. Севастополь                                                                                                             Получено 05.02.2002

D. V. B O R O D I N

Страницы:
1  2 


Похожие статьи

Д В Бородин - Средства измерительной техники для измерения показа телей ка чества электрической энергии

Д В Бородин - Стимуляция биолюминесценции морских динофлагеллят

Д В Бородин - Стимуляция биолюминесценции морских динофлагеллят