Н М Береговая, И Н Гудвилович - Хранение водно-спиртового экстракта с-фикоцианина полученного из микроводоросли spirulina platensis - страница 1

Страницы:
1 

УДК 582.232:57.018.6

 

Н. М. Б Е Р Е Г О В А Я, И. Н. Г У Д В И Л О В И Ч

 

ХРАНЕНИЕ ВОДНО-СПИРТОВОГО ЭКСТРАКТА С-ФИКОЦИАНИНА, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ МИКРОВОДОРОСЛИ SPIRULINA PLATENSIS

Рассматриваются различные способы хранения водного раствора С-фикоцианина, пигмента мик­роводоросли Spirulina platensis (Nordst) Geitler, имеющего широкое применение в фармакологии и пищевой промышленности. На основании полученных данных сделан вывод о предпочтитель­ном хранении раствора С-фикоцианина в темноте при температуре 3 - 5 °С при добавлении в качестве консерванта этанола конечной концентрации в растворе 20 %. Проведено ранжирование факторов, вызывающих разложение водного раствора пигмента: влияние света, доступ кислорода, высокая исходная концентрация сухого вещества спирулины, отсутствие консерванта. Выявлена оптимальная концентрация сухого вещества спирулины для экстракции и последующего хранения С-фикоцианина.

Ключевые слова: Spirulina platensis, С-фикоцианин, хранение пигмента.

С-фикоцианин относится к классу фикобилипротеинов [2, 4] и является водорас­творимым пигментом, применяемым в медицине и фармакологии из-за уникальных он-копротекторных и иммуномодулирующих свойств Известно, что С-фикоцианин имеет большую антиоксидантную активность, чем р-каротин и а-токоферол [6]. Он использует­ся в цитометрии и пищевой промышленности благодаря яркой флуоресцентной окраске [5, 8]. Основным сырьевым источником для получения С-фикоцианина служит сине-зеленая микроводоросль Spirulina platensis [3].

Будучи широко используемым в различных областях биопромышленности, С-фикоцианин является крайне нестабильным: быстро разлагается на свету, при темпера­турном воздействии свыше 5 °С, во время длительного хранения (значительные потери пигмента происходят в течение двух лет в сухих образцах спирулины) [1]. В биотехноло­гии ставится вопрос о выделении С-фикоцианина в чистом виде, например, в кристалли­ческой форме или в виде водного экстракта. Однако применение пигмента в кристалли­ческой форме лимитировано достаточно высокой ценой указанного способа выделения [8]. Поэтому актуальной является проблема разработки условий хранения водного экс­тракта пигмента, решение которой помогло бы обеспечить широкое применение С-фикоцианина в биопромышленности. В этой связи нами была поставлена задача выявить оптимальные условия хранения водного экстракта С-фикоцианина при добавлении эта­нола различной конечной концентрации в качестве консерванта, а также определить влияние доступа кислорода и концентрации сухого порошка спирулины на хранение водного экстракта.

Материал и методы. Объектом исследования служила культура Spirulina pla­tensis (Nordst) Geitler штамм IBSS-31 из коллекции ИнБЮМ НАН Украины [3]. Культу­ру данной микроводоросли выращивали в прямоугольных бассейнах в квазинепрерыв­ном режиме при суточном обмене 10 %, поверхностной освещённости культуры - 40 Вт- м-2, температуре - 22 - 24 °С. Для культивирования использовали модифицированную среду Заррук. Биомассу S. platensis промывали проточной водой и высушивали в су­шильном шкафу при температуре 55 °С. Затем 3 г сухого порошка спирулины заливали небольшим количеством дистиллированной воды, разливали в несколько чашек Петри, двукратно замораживали и размораживали с целью разрушения клеточных оболочек макроводоросли и быстрого извлечения С-фикоцианина. Гомогенат центрифугировали при 3000 об. - мин 1 на лабораторной центрифуге ОПН-3. Центрифугаты сливали вместе

© Н. М. Береговая, И. Н. Гудвилович, 2010

Экология моря. 2010. Спец. вып. 81и замеряли объём. Оптическую плотность экстрактов, предварительно десятикратно раз­ведённых дистиллированной водой, промеряли на КФК-3 на длинах волн 620 и 750 нм по стандартной методике [9]. Далее образцы экстрактов доводили 70 % этанолом до ко­нечной концентрации этанола в растворе соответственно 10, 20, 30 и 40 %. Хранение экстрактов осуществляли в следующих вариантах: в темноте при температуре 3 - 5 °С; в темноте при температуре 15 - 17 °С, в условиях освещённости 300 - 500 Лк при темпе­ратуре 15 - 17 °С. Контролем служил экстракт С-фикоцианина без добавления консер­ванта (хранение при температуре 3 - 5 °С в темноте). При выявлении оптимальной кон­центрации исходного вещества спирулины для хранения из полученного экстракта гото­вили следующий концентрационный ряд водного раствора спирулины: 100; 69,6; 33,5 и 24,8 % (23, 16, 7,7 и 5,7 мг - мл -1, соответственно). В экстракты добавляли 70 % этанол до конечной концентрации консерванта в растворе 20 %. На протяжении 25 дней изме­ряли оптическую плотность растворов на КФК-3 при длинах волн 620 нм и 750 нм по стандартной методике [9]. Хранение экстрактов осуществляли в темноте при температу­ре 3 - 5 °С. Для определения влияния доступа кислорода часть пробирок с экстрактом оставляли открытыми и хранили без консерванта.

Результаты и обсуждение. Полученные нами результаты по разложению С-фикоцианина в различных условиях представлены на рис. 1, 2, 3. Из них видно, что ус­ловия хранения С-фикоцианина при конечной концентрации этанола в экстракте 40 % являются наиболее худшими: разложение пигмента при температуре 15 - 17 °С на свету происходило за 3 дня, в 30 %-м растворе - за 5,5 дней, в то время как в 20 и 10 %-м рас­творе этанола концентрация С-фикоцианина уменьшалась всего лишь от 1 до 0,2 относи­тельных единиц (отн. ед.) за 13 дней (рис. 1).


я

ь

ш

W

я я

я

я я

о


К 0.4 -Я

я о,

я

В 0.2-

я

о


40 %

0


0


0


0

Рисунок 1. Разложение С-фикоцианина в растворах этанола различной концентра­ции при хранении на свету Figure 1. Decomposition of C-phycocyanin in different concentration ethanol solutions during keeping on light

Рисунок 2. Разложение С-фикоцианина в
растворах     этанола различной

концентрации при хранении в темноте Figure 2. Decomposition of C-phycocianin in different  concentration ethanol solutions during keeping at darkness

При температуре 15 - 17 °С в темноте пигмент сохранялся несколько лучше: в 40 %-м этаноле концентрация падала до 0,2 отн. ед., в 30 %-м этаноле - до 0,4 отн. ед. за 13 дней, тогда как в 20 и 10 %-м этаноле за таком же временном интервале концентра­ция С-фикоцианина снизилась в 1,4 и 1,25 раза, соответственно (рис. 2). Наиболее бла­гоприятным было хранение С-фикоцианина в темноте, при температуре 3 - 5 °С (рис. 3). При концентрации этанола в экстракте 10 и 20 % при таком режиме хранения изменения оптической плотности были незначительными: от 1 до 0,9 отн. ед. в течение 13 сут. Сходными были изменения концентрации С-фикоцианина в пробах с аналогичными концентрациями этанола, находящимися на хранении при температуре 15 - 17 °С в тем­ноте (изменения от 1 до 0,85 - 0,79 отн. ед.). Оптическая плотность контрольной пробы изменялась от 1 до 0,8 отн. ед. Экстракты С-фикоцианина с концентрацией этанола 10 и 20 % при хранении в холодильнике (температура 3 - 5 °С) практически не меняли окра­ску в течение 2 мес. Однако, конечная концентрация этанола 10 % в растворе С-фикоцианина является недостаточной для подавления развития микрофлоры, поэтому предпочтительнее остановиться на конечной концентрации этанола 20 %. Быстрое раз­рушение пигмента в 30 и 40 %-м растворах этанола, вероятно, можно объяснить процес­сами денатурации, которые, очевидно, происходят в протеиновой части С-фикоцианина при этих концентрациях этанола.


40 %

0.4 -

0.2 ■

0

- 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5

Полученные нами данные по из­менению концентрации С-фикоцианина при хранении c консервантом (20 % эта­нол) в зависимости от концентрации ис­ходного раствора сухого вещества спиру-лины представлены на рис. 4.

0

16

-ж—ж

а 3

О

 

Рисунок 4. Изменение концентрации С-фикоцианина при хранении с консерван­том в водном растворе в зависимости от исходной концентрации спирулины (1 - 23 мг- мл-1, 2 - 16 мг- мл-1, 3 - 7,7 мг- мл-1, 4 - 5,7 мг- мл-1)

1     4 5

7    12   14 25

Дни

Figure 4. Change of C-phycocianin concentra­tion at storage in a water solution with pre­servative depending on initial concentration of spirulina (1 - 23 mg- ml1, 2 - 16 mg- ml1, 3 -7,7 mg- ml-1, 4 - 5,7 mg- ml-1)

Из рис. 4 видно, что разложение С-фикоцианина в растворе с исходной концен­трацией 5,7 - 7,7 мг - мл -1 практически не наблюдалось, в отличие от растворов с ис­ходными концентрациями 16 и 23 мг - мл -1. Более наглядно влияние исходной концен­трации сухого вещества микроводоросли на процесс разложения С-фикоцианина про­слеживается в эксперименте без добавления в качестве консерванта этанола (рис. 5).

Концентрация С-фикоцианина в растворе с исходной концентрацией спирулины 23 мг - мл 1 через 25 дней уменьшилась в 3,3 раза, с концентрацией 16 мг - мл 1 снизи­лась в 2 раза, в то время как в растворе с исходной концентрацией 7,7 и 5,7 мг- мл-1 раз­

ложения пигмента практически не происходило. Результаты эксперимента по изучению влияния кислорода на хранение экстракта пигмента представлены ниже (рис. 6).

1,2

«

я 1

S я 0,8 я я

§ g 0,6 и я

 

о 0,2 я


5 0

В ходе эксперимента выявлено, что во всех пробах резкое снижение уровня С-фикоцианина наблюдалось при доступе кислорода через 12 дней. Однако, его снижение при высоких исходных концентрациях спирулины происходило в 10 и в 8 раз соответст­венно, а при более низких концентрациях - в 5 и 6 раз. Таким образом, влияние кисло­рода на хранение пигмента снижалось в 2 раза.

Для сравнения факторов, оказывающих воздействие на разложение водного рас­твора С-фикоцианина, обратимся к рис. 7. Установлено, что факторами, оказывающими наибольшее влияние на уменьшение концентрации С-фикоцианина в водном экстракте в процессе хранения, являются свет и доступ кислорода. Оба фактора вызывают снижение концентрации пигмента в 5 раз на 12 сутки.


Хранение неразбавленного экстракта при исходной концентрации спирулины 26 мг- мл -1 приводит к уменьшению уровня С-фикоцианина на 20 % за этот же интервал времени. Аналогичные результаты наблюдаются при хранении экстракта без консерванта и тем­пературе 17 °С.

Таким образом, наиболее лимитирующими факторами, вызывающими разложе­ние водного экстракта С-фикоцианина, являются свет и доступ кислорода. Далее по сте­пени воздействия следуют: хранение в виде неразбавленного экстракта, отсутствие кон­серванта и хранение при комнатной температуре (17 - 18 °С).

Заключение. На основании полученных результатов можно сделать вывод о предпочтительном хранении водного экстракта С-фикоцианина в темноте при темпера­туре 3 - 5 °С с добавлением этанола конечной концентрации 20 % в экстракте в качестве консерванта, при относительно невысокой исходной концентрации сухого вещества спи-рулины (не выше 10 мг - мл -1). Экономичность описанного способа выделения и хране­ния водно-спиртового раствора С-фикоцианина могут обеспечить широкое применение его в медицинской практике. Ранжирование факторов, лимитирующих хранение водного раствора С-фикоцианина, позволяет выстроить их в следующий ряд: свет, доступ кисло­рода, высокая концентрация сухого вещества спирулины (25 мг - мл -1), отсутствие кон­серванта, воздействие комнатной температуры (17 - 18 °С).

1.   Береговая Н. М. Изменение параметров химического состава сине-зелёной водоросли Spirulina platensis при длительном хранении // Новые информац. технологии в медицине и экологии: ІХ Юбилейная междунар. конф. и дискус. науч. клуб (Ялта-Гурзуф, 1 - 10 июня 2002). - Ялта,

2002. - С. 64.

2.   Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. - М.: Мир, 1986. - 422 с.

3.   Брянцева Ю. В., Дробецкая И. В., Харчук И. А. Характеристика цианобактерии Spirulina (Arth-rospira) platensis // Экология моря. - 2005. - Вып. 70. - С. 24 - 30.

4.   Стадничук И. Н. Фикобилипротеины. - Биологическая химия (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). - М., 1990. - 40. - 196 с.

5.   Becker E. W. Development of Spirulina research in a developing country India / Spirulina - Algae of Life. - Bul. 1st. Oceanogr., 1993. - No 12. - P. 141 - 155.

6.   Belay A. The potential Application of Spirulina (Arthrospira) as nutritional and therapeutic supple­ment in health management // J. Amer. Nutraceutical Assoc. - 2002. - 15, No 2. - P. 27 - 49.

7.   Cysewski G. R. Feeds, foods and pigments from Spirulina // J. Phycol. - 1992. - 28, No 3. - P. 12 -

16.

8.   Hackert M. L, Abad-Zapatero C., Stevens S. E., Fox J. L. Cristallization of C-phycocyanin from the marine blue-green algae Agmenellum guadruplicatum // Mol. Biol. - 1977. - 111, No 3. - P. 365 -

369.

9.   Vonshak A. Spirulina platensis (Arthrospira): Physiology, Cell-biology and Biotechnology. - Taylor and Francis, 1996. - 233 p.

10.Ce W. G., Cheng Z. B., Kui Z. C. Purification of C-phycocyanin from Spirulina platensis and R-phycoerythrin from Polysiphonia urceolata and determination of their molar extinction coefficient // Mar. Sci. - 1996. - No 1 - P. 52 - 55.

 

Институт биологии южных морей НАН Украины,

г. Севастополь, Украина                                                        Получено 08.02.2010 г.

 

Н. М. Б Е Р Е Г О В А, І. М. Г У Д В І Л О В И Ч

ЗБЕРІГАННЯ ВОДНО-СПИРТОВОГО ЕКСТРАКТУ С-ФІКОЦІАНІНУ, ОТРИМАНОГО З МІКРОВОДОРОСТІ SPIRULINA PLATENSIS

Резюме

Розглянуто різні способи зберігання водного розчину С-фікоціаніну, пігменту мікроводорості Spirulina platensis (Nordst) Geitler, що має широке застосування у фармакології та харчової про­мисловості. На підставі отриманих даних зроблено висновок про краще зберігання розчину С-фікоціаніну в темряві при температурі 3 - 5 °С при додаванні в якості консерванту етанолу кінце­вої концентрації в розчині 20 %. Проведено ранжирування факторів, які викликають розкладання водного розчину пігменту: вплив світла, доступ кисню, висока початкова концентрація сухої речо­вини спіруліни, відсутність консерванту. Виявлено оптимальну концентрацію сухої речовини спі-руліни для екстракції та наступного зберігання С-фікоціаніну.

Ключові слова: Spirulina platensis, С-фікоціанін, зберігання пігменту.

 

N. M. B E R E G O V A Y A, I. N. G U D V I L O V I C H C-PHYCOCIANIN WATER EXTRACT КЕЕРШС FROM MICROALGAE SPIRULINA PLATENSIS

Summary

Different kinds of keeping of C-phycocyanin water extract (a pigment from microalgae Spirulina platen­sis (Nordst.) Geitler which is widely used in pharmacology and food industry) have been observed. On the basis of our data it was concluded that the most acceptable kinds of keeping is in darkness with temperature 3 - 5 °C adding 20 % ethanol as a conservant. Ranking of factors leading to decomposition of pigment water extract was made (light and oxygen influence, high initial concentration of dry spiruli-na, absence of conserve). Optimal initial concentration of spirulina dry substance for extraction and following С-phycocyanin keeping was found.

Key words: Spirulina platensis, С-phycocyanin, pigment keeping.

Страницы:
1 


Похожие статьи

Н М Береговая, И Н Гудвилович - Хранение водно-спиртового экстракта с-фикоцианина полученного из микроводоросли spirulina platensis